Alte orale Mikrobiome unterstützen die allmähliche Umstellung der neolithischen Ernährung auf die Landwirtschaft

Nature Communications Band 13, Artikelnummer: 6927 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Das menschliche Mikrobiom ist in letzter Zeit zu einer wertvollen Informationsquelle über das Leben und die Gesundheit des Wirts geworden. Bisher ist wenig darüber bekannt, wie es sich in Schlüsselphasen unserer Geschichte, wie etwa dem neolithischen Übergang zur Landwirtschaft, entwickelt haben könnte. Hier beleuchten wir die Entwicklung des oralen Mikrobioms während dieses Übergangs und vergleichen paläolithische Jäger und Sammler mit neolithischen und kupferzeitlichen Bauern, die dasselbe Sperrgebiet in Italien bevölkerten. Wir integrieren die Analyse von 76 oralen Mikrobiomen von Zahnstein mit den Ernährungsinformationen, die aus der Identifizierung eingebetteter Pflanzenreste abgeleitet werden. Wir stellen eine stärkere Abweichung von der Mikrobiomzusammensetzung der Jäger und Sammler im letzten Teil des Neolithikums fest, während sie in den frühen Phasen des Übergangs in geringerem Maße auftritt. Unsere Ergebnisse zeigen, dass die Einführung der Landwirtschaft das Mikrobiom des Wirts beeinflusste, was die Hypothese eines allmählichen Übergangs innerhalb der untersuchten Populationen stützt.

Im letzten Jahrzehnt haben mehrere Studien das Mikrobiom als eine Art Schnittstelle zwischen dem Menschen und seiner Umgebung identifiziert. Das menschliche Mikrobiom ist in der Lage, die Gesundheit des Wirts durch mehrere Mechanismen zu beeinflussen1,2 und wird wiederum durch Variablen geprägt, die mit den Lebensbedingungen des Wirts zusammenhängen (z. B. Lebensstil, Umwelt), mehr als durch die Genetik des Wirts3,4. Seit Beginn der metagenomischen Analysen des menschlichen Mikrobioms wurde die Existenz enormer Variabilität innerhalb der Zusammensetzung des Darmmikrobioms zwischen verschiedenen Populationen auf der ganzen Welt hervorgehoben5,6. Dennoch bleibt die Frage offen, wie diese mikrobiellen Gemeinschaften während der menschlichen Evolution entstanden sind und sich gemeinsam mit ihren Wirten entwickelt haben.

Untersuchungen an alter DNA (aDNA) könnten es uns möglicherweise ermöglichen zu erklären, wie sich diese komplexen mikrobiellen Gemeinschaften im Laufe der Zeit entwickelt haben, um ihre heutige Zusammensetzung zu erreichen, und darüber hinaus könnten sie wesentliche Informationen über vergangene Gesellschaften, Kulturen und Lebensbedingungen liefern7,8. Forscher erwägen derzeit die Untersuchung des antiken Mikrobioms aus Koprolithen (d. h. versteinerten Fäkalienresten) und Zahnstein als Hilfsmittel, die wesentlich dazu beitragen könnten, die Entwicklung menschenassoziierter mikrobieller Gemeinschaften aufzudecken9,10.

Eine der offenen Fragen zur Entwicklung des menschlichen Mikrobioms hängt damit zusammen, wie der Übergang zur Landwirtschaft während der Jungsteinzeit die Zusammensetzung und Biodiversität des oralen Mikrobioms beeinflusste. An modernen Populationen durchgeführte Analysen haben beim Vergleich traditioneller oder Jäger-Sammler-Gesellschaften mit städtischen Gemeinschaften Veränderungen in der oralen mikrobiellen Ökologie festgestellt11,12,13,14. Allerdings haben neuere Studien, die sich auf den Übergang zur Landwirtschaft in unserer Vergangenheit konzentrierten, zu kontroversen Ergebnissen geführt. Vorläufige antike orale Mikrobiomdaten deuten beispielsweise auf eine Verschiebung der Bakterienartenhäufigkeit im Zusammenhang mit dem neolithischen Übergang hin, die in einer neueren Studie zur oralen Mikrobiomentwicklung nicht reproduziert werden konnte8,15. Weitere Untersuchungen in Südeuropa fanden nur geringe Variationen im Zusammenhang mit dem Übergang und identifizierten hauptsächlich geografische Muster der Variation des Bakteriengenoms16. Bisher stützten sich Studien zum antiken neolithischen Mikrobiom meist auf kleine Gruppen von Proben, die über ein weites geografisches Gebiet verteilt waren, das durch unterschiedliche ökologische Bedingungen und Lebensunterhaltsstrategien gekennzeichnet war, was zu möglichen geografischen und ernährungsbedingten Verzerrungen führte. Tatsächlich scheinen die mikrobiellen Gemeinschaften, die Zahnbelag bewohnen, wie bei verschiedenen Mikrobiomquellen beobachtet, von der Ernährung, der Ökologie und den Lebensbedingungen beeinflusst zu werden17,18,19. Darüber hinaus deuten archäologische Beweise darauf hin, dass der neolithische Übergang kein monolithisches Ereignis war, sondern dass es Unterschiede in den angenommenen Subsistenzstrategien zwischen den gleichaltrigen Gemeinschaften gab20,21,22. Diese Beweise könnten erklären, warum beim Vergleich verschiedener neolithischer Gemeinschaften, die durch kleine Stichprobengrößen und unterschiedliche ökologische Bedingungen gekennzeichnet sind, hauptsächlich geografische Variationsmuster und nicht kulturelle Veränderungen festgestellt werden16, sodass diese Frage offen bleibt. Dementsprechend ist die Berücksichtigung sowohl des archäologischen Hintergrunds als auch des ökologischen Kontexts von grundlegender Bedeutung für die Kontextualisierung des Einflusses der landwirtschaftlichen Umstellung auf das orale Mikrobiom.

In Italien begann der Übergang zur Landwirtschaft um 6.200 v. Chr. im Südosten der Halbinsel, in einer Region, die heute als Apulien bekannt ist, wo Bevölkerungsgruppen aus der Levante dieses Land über Migrationsrouten über das Mittelmeer erreichten23. Hier wurde der Übergang vom Jäger und Sammler zur Agrarsubsistenzwirtschaft als erster in Italien und als einer der ältesten in Westeuropa dokumentiert23. Die ersten Phasen waren geprägt von einigen Familiengruppen, die in kleinen Dörfern organisiert waren und eine typische Art der Keramikproduktion namens „Impressed Ware“23 betrieben. Im Laufe der nächsten zwei Jahrtausende breiteten sich diese Gemeinschaften nach Norden aus, entwickelten komplexere soziale Strukturen und passten auch ihr landwirtschaftliches Subsistenzsystem als Reaktion auf lokale Ressourcen und Umweltbedingungen an24. Im letzten Jahrzehnt war diese Region Gegenstand zahlreicher paläo- und paläoökologischer Untersuchungen mit dem Ziel, die Dynamik der Neolithisierung zu rekonstruieren, und stellt somit eine perfekte Fallstudie für die Untersuchung der Beziehung zwischen Wirt und Mikrobiom zum Zeitpunkt des Übergangs dar24,25,26 . Insgesamt ist die Jungsteinzeit in diesem Gebiet in vier Hauptkulturphasen unterteilt: Frühneolithikum (entspr. Impressed Ware-Kultur), Mittelneolithikum (entspr. Passo di Corvo-Kultur), Endmittelalter (entspr. Serra d'Alto-Kultur) und Spätneolithikum ( entspr. Diana-Kultur)23.

Ziel der vorliegenden Studie ist es daher, Fragen im Zusammenhang mit den Auswirkungen neolithischer Ernährungsumstellungen auf das orale Mikrobiom zu beantworten und dabei Ernährungs-, Kultur- und Umweltinformationen zu integrieren. Wir schlagen einen alternativen Ansatz zur Untersuchung der Entwicklung der Mikrobiomzusammensetzung im Zusammenhang mit dem landwirtschaftlichen Übergang vor, indem wir mögliche geografische Verzerrungen minimieren und uns ausschließlich auf Mittel-Süditalien als Fallstudie konzentrieren (insbesondere auf die Region Apulien) und den kulturellen und ernährungsbedingten Kontext berücksichtigen jede Gemeinde. Wir analysieren zunächst neun Jungpaläolithikum-Sammlerproben aus der Paglicci-Höhle (31.000–11.000 v. Chr.), um sowohl das vorlandwirtschaftliche Mikrobiom weiter zu beschreiben als auch einen regionalen Bezug zum Vergleich mit den neolithischen Besonderheiten zu erhalten. Bisher wurden in diesem Gebiet keine mesolithischen Individuen nachgewiesen. Um die mit dem Übergang verbundenen Veränderungen besser berücksichtigen zu können, konzentrieren wir uns auf eine Reihe von 67 Proben aus der Jungsteinzeit (6200–4000 v. Chr.) bis zur Kupferzeit (3500–2200 v. Chr.) und kreuzen dabei alle vier Phasen, aus denen die Jungsteinzeit bestand Region und entsprechend unterschiedlichen kulturellen Hintergründen. Um den Informationsgehalt des antiken Zahnsteins zu erweitern, haben wir außerdem einen integrierten Ansatz angewendet, der metagenomische Daten mit mikroskopischer Analyse koppelt, um Ernährungsinformationen über die verzehrten Pflanzen zu erhalten. Wir identifizieren zwei bisher unbeschriebene Verschiebungen in der Mikrobiomzusammensetzung der untersuchten Populationen. Die erste Veränderung fand zwischen lokalen Jäger- und Sammlergemeinschaften und neolithischen Bauern statt, während eine zweite unerwartete große Veränderung im letzten Teil der Jungsteinzeit festgestellt wurde. Einige der taxonomischen und funktionalen Veränderungen wurden wahrscheinlich durch Änderungen in den Subsistenzstrategien vorangetrieben.

Wir haben 79 Proben aus Mittel- und Süditalien gesammelt (Abb. 1), wobei wir Proben von Jägern und Sammlern aus dem oberen Paläolithikum (PA), Proben aus der postneolithischen Kupferzeit (CA) und alle verschiedenen neolithischen Phasen berücksichtigt haben (Ergänzungsdaten 1): Frühneolithikum (EN), Mittelneolithikum (MN), der letzte Teil des Mittelneolithikums (FMN) und Spätneolithikum (LN). Sechsundsiebzig (76) der gesammelten Proben wurden auf ihre metagenomischen Profile untersucht. Es wurden durchschnittlich 28 Millionen Lesevorgänge pro Probe erzeugt (Supplementary Data 2). Davon konnten durchschnittlich 12,94 % der Messwerte Bakterien und Archaeen zugeordnet werden, während nur ein kleiner Anteil Eukaryoten zuzuordnen war (Mittelwert 0,01 %). Die erhaltenen alten Mikrobiomprofile wurden zusammen mit anderen alten veröffentlichten oralen Mikrobiomen und modernen oralen Proben gruppiert (Ergänzungsdaten 3 und Ergänzungsabbildung 1). Um die Robustheit unserer Ergebnisse zu bestätigen, haben wir sie durch eine Sourcetracker-Analyse bestätigt, bei der die Mehrheit der alten Proben (71) eine starke Übereinstimmung mit dem oralen Mikrobiomprofil (> 90 %) zeigte (ergänzende Abbildung 2). Nur wenige Proben zeigten ein kontaminiertes Profil und wurden daher von der weiteren Analyse ausgeschlossen.

Beprobte Verteilung archäologischer Stätten auf der mittel-süditalienischen Halbinsel. Die Anzahl der Proben pro Standort ist in Klammern angegeben. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt. Die Karte wurde mit dem Paket rnaturaleartch (v 0.1.0) auf R-Software generiert.

Wir haben die am häufigsten vorkommenden Mikrobenarten ausgewählt, die im gesamten Datensatz eine relative Häufigkeit von mehr als 0,02 % aufwiesen. Dieser Schwellenwert ermöglichte es uns, insgesamt 49 Arten zu erhalten und Arten mit geringer Häufigkeit und Einzeltiere zu vermeiden. Die erhaltenen Spezies wurden anschließend hinsichtlich ihrer Desaminierungsprofile validiert (Ergänzende Daten 4 und Ergänzende Abbildung 3). Bei allen Proben wurde ein enges Desaminierungsprofil festgestellt, ohne dass im Laufe der Zeit signifikante Unterschiede festgestellt wurden (weitere taphonomische Informationen finden Sie in der ergänzenden Diskussion und in den ergänzenden Abbildungen 4 und 5).

Wir führten eine Netzwerkanalyse durch, um Probenähnlichkeiten zu untersuchen, und entdeckten fünf verschiedene Cluster (C1-5) (Abb. 2a). Die Clusterunterteilung wurde mithilfe von PERMANOVA und dem ANOSIM-Test an einer PCoA-Darstellung validiert und bestätigte, dass sie tatsächlich von der Mikrobiomzusammensetzung beeinflusst wurde und nicht mit anderen Störfaktoren (z. B. Extraktion oder Bibliothekscharge oder Lesezahlen) zusammenhängt (Ergänzende Abbildungen 6, 7). und ergänzende Daten 5a und b). Gemäß der zufälligen Waldklassifizierung wurde der Zeitraum als primärer Faktor für diese Clusterunterscheidungen identifiziert, während die geografische Lage ein sekundärer Faktor war (Abb. 2b). Daher können wir von einem Mischeffekt von Zeit und Geographie ausgehen, wobei die chorische Periode einen etwas stärkeren Einfluss hat als die Geographie. Tatsächlich zeigte die Assoziationsanalyse zwischen den Clustern und der Periode (Abb. 2c und ergänzende Abb. 8), dass der erste Cluster (C1) signifikant mit der PA-Periode assoziiert war, während der zweite (C2) hauptsächlich mit Early (EN) assoziiert war ) und mittelneolithische (MN) Proben. Die Fundstelle Palagiano, die zum Ende des Mittelneolithikums (FMN) gehört, war sowohl dem 3. als auch dem 5. Jh. zugeordnet, was auf die Möglichkeit einer weiteren Unterstruktur innerhalb derselben Fundstelle schließen lässt. Es ist bemerkenswert, dass C3 größtenteils aus Proben besteht, die zum selben Grab gehören (PT10.x), während C5 aus Proben besteht, die zu verschiedenen Bestattungen in Palagiano gehören. Schließlich ist C4 unabhängig von der geografischen Lage in erheblichem Maße mit dem Spätneolithikum (LN) und der Kupferzeit (CA) verbunden.

a Netzwerkanalyse zwischen Proben. Die Kantendicke basiert auf ihren Gewichten, die nicht negative Ähnlichkeiten zwischen Proben anzeigen, während die Kantenlänge den Knotenabstand basierend auf dem Aitchison-Abstand darstellt. Die Knotenfarbe wird durch den Cluster definiert, der durch die hierarchische Clusteranalyse identifiziert wurde, und die schwarze Randfärbung um den Knoten identifiziert die Hubs. b Zufällige Waldklassifizierungsanalyseergebnisse, die die Bedeutung von Zeitraum und Geographie (Standort) als Hauptvariablen hervorheben, die die Grundlage für die Clusterunterschiede bilden, während das Sterbealter (Alter) keine Unterscheidungskraft hat. c Übereinstimmung der untersuchten Zeit (dh Chronologie) mit dem kulturellen Hintergrund (zweiter Block), der ausgewählten archäologischen Stätte (dritter Block) und den Ergebnissen der Clusteranalyse (C1-C5), berichtet in Panel a. Im Block „Kultureller Hintergrund“ wird jede neolithische Kultur durch eine andere Farbe definiert, die ihre Verbindung zu den archäologischen Stätten (dritter Block) und zur spezifischen neolithischen Phase hervorhebt, über die in den Überschriften des Blocks „Cluster“ (d. h. EN) berichtet wird , MD, FMN, LN). Im letzten Block (der als „Cluster“ bezeichnet wird) werden die Probennummern auf der x-Achse und die Clusteranmerkungen auf der y-Achse angegeben. Die Farbe jedes Balkens ist den in Tafel a angegebenen Clusterfarben zugeordnet. In jedem Balken ist der Prozentsatz der Proben, die in einen bestimmten Cluster fallen, fett gedruckt. Hier können wir anhand der Clusterzeilen erkennen, dass PA-Proben im ersten Cluster (C1) zusammenfallen, während EN und MN im C2 liegen. LN und CA kommen vor allem in C4 vor, während FMN auf C3 und C5 verteilt ist. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Diese Beweise deuten auf die Existenz eines spezifischen Mikrobiomprofils hin, das mit den PA-Proben von Jägern und Sammlern in Zusammenhang steht, und darüber hinaus darauf, dass einige Unterschiede sogar innerhalb derselben neolithischen Periode erkennbar sind. Insbesondere Proben aus den ersten Jahrhunderten des neolithischen Übergangs in diesem Gebiet weisen eine sehr ähnliche Mikrobiomzusammensetzung auf und unterscheiden sich deutlich von Proben aus der LN- und CA-Periode. Bei der DESeq2-Analyse wurde festgestellt, dass zweiundvierzig (42) Arten unterschiedlich auf die Cluster verteilt sind, wobei einige von ihnen in bekannte ökologische Komplexe für das orale Mikrobiom fallen (Abb. 3a–e, Zusatzdaten 6). Die meisten Arten, die zum selben Komplex gehören, weisen einen ähnlichen Trend auf, was aufgrund ihrer metabolischen Abhängigkeit und ökologischen Assoziation zu erwarten ist27. Unter den Arten, die diese Komplexe charakterisieren, können wir zwei wesentliche taxonomische Trends beobachten: einen für Arten, die in PA-Proben nur schwach vertreten sind, deren Zahl aber mit Beginn des neolithischen Übergangs zuzunehmen beginnt; und ein zweiter Trend, bei dem Arten, die in den PA-Proben häufiger vorkommen, im Laufe der Zeit tendenziell langsam abnehmen und ihre niedrigsten Werte in LN und CA erreichen. Bedeutende Arten der Roten (Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsythia und Treponema denticola), Orangen (Campylobacter gracilis, Campylobacter rectus, Campylobacter showae und Prevotella intermedia) und Grünen (Capnocytophaga endotelialis, Capnocytophaga haemolytica, Capnocytophaga ochracea, Capnocytophaga sputigena und Eikenella). corrodens)-Komplexe folgen Sie dem ersten Trend; Daher sind sie in den PA-Proben nur schwach vorhanden, um dann zu Beginn der Jungsteinzeit allmählich stärker vertreten zu sein, aber erst am Ende dieser Periode erreichen sie die höchste Häufigkeit. Pophyromonas gingivalis war laut MaAsLin-Analyse auch positiv mit C4 und damit mit den LN/CA-Perioden assoziiert, während Campylobacter gracilis sowohl mit C2 als auch C4 assoziiert war (Ergänzende Abbildung 9 und Ergänzende Daten 7).

ein roter Komplex; b Orangenkomplex; c Purpurkomplex; d gelber Komplex; Der grüne Komplex. Weitere wichtige orale Arten sind in der ergänzenden Abbildung 10 aufgeführt. Proben (n = 71) werden durch Punkte dargestellt und sind je nach Art gefärbt. Boxplots sind wie folgt definiert: Minimal-, Maximal- und Mittelwerte stellen das 25-, 75- bzw. 50-%-Quantil dar; Der Median wird durch das 50 %-Quantil dargestellt. Obere und untere Whiskers sind die Maximal-/Minimalwerte von Daten, die innerhalb des 1,5-Interquartilbereichs über dem 75. bzw. unter dem 25. Perzentil liegen. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Taxa aus den violetten (Actinomyces spp.) und gelben (Streptococcus gordonii, Streptococcus mitis, Streptococcus oralis und Streptococcus sanguinis) Komplexen folgten dem zweiten Trend, wobei sie während der PA-Periode stark präsent waren und ihre Häufigkeit mit der Zeit abnahm. Die einzige Ausnahme in diesem Sinne vom Purpurkomplex war Actinomyces sp. orales Taxon 414 (Abb. 3c, oberes Diagramm). Darüber hinaus bestätigte das MaAsLin-Ergebnis auch in diesem Fall eine starke negative Assoziation für alle genannten Streptococcus spp. mit fast allen neolithischen und CA-Clustern (ergänzende Abbildung 9), während eine positive Assoziation von Actinomyces naeslundii und Actinomyces slackii mit der PA-Periode festgestellt wurde.

Andere Mitglieder des oralen Mikrobioms veränderten ihre Häufigkeit im Laufe der Zeit erheblich, wie zum Beispiel Olsenella sp. orales Taxon 807, Parvimonas micra, Desulfomicrobium orale und Ottowia sp. orales Taxon 894, das in allen neolithischen Proben weit verbreitet zu sein scheint, während Streptococcus sp. Das orale Taxon 061, Abiotrophia defektica und Klebsiella pneumonieae wurden im PA-Datensatz angereichert (ergänzende Abbildung 10). Olsenella sp. Das orale Taxon 807 zeigte einen starken Zusammenhang mit dem neolithischen Übergang, da MaAsLin eine positive Assoziation sowohl mit C2 als auch C4 und damit mit den beiden großen neolithischen Clustern hervorhob, während Desulfomicrobium orale speziell mit dem C4-Cluster assoziiert war.

Proben aus den ersten Phasen der Jungsteinzeit (EN und MN) zeigten, obwohl sie aus unterschiedlichen archäologischen Stätten stammten, ein recht homogenes taxonomisches Profil und eine mikrobielle Zusammensetzung, die sich offenbar in einer Zwischenposition zwischen der PA- und der LN/CA-Periode befand. Wir können daher die Hypothese aufstellen, dass die erste Phase des Neolithikums eine Art „Übergangszustand“ zwischen den beiden Extremen der Mikrobiomzusammensetzungen PA und LN/CA darstellt. Sie zeichnen sich durch Elemente aus, die mit LN und CA gemeinsam sind, und gleichzeitig scheinen sie nicht so weit von der Zusammensetzung der Jäger-Sammler-Proben entfernt zu sein.

Zusätzlich zur taxonomischen Zusammensetzung haben wir auch die mikrobiellen Funktionen charakterisiert, um frühere Analysen zu bestätigen und zu testen, wie sich diese Veränderungen in einem mikrobiellen genetischen Funktionspaket widerspiegeln können. Wir haben festgestellt, dass mehrere KEGG-Orthologe für jeden der taxonomisch basierten Cluster spezifisch sind (ergänzende Abbildung 11).

KEGG-Orthologe, die mit dem Kohlenhydratstoffwechsel in Zusammenhang stehen (z. B. Pyruvat, Propanoat, Ascorbat, Aminozucker und Stärkestoffwechsel), sind in PA-Proben besonders angereichert (Abb. 4a). Kürzlich wurde festgestellt, dass diese Merkmale hauptsächlich mit der Anwesenheit von Streptokokken in Zusammenhang stehen, die in dieser Probengruppe höher sind, sowie mit der Fähigkeit, Wirts-Amylase-Proteine ​​zu binden8,28. Die neolithischen Proben sind jedoch alle mit anderen charakteristischen Merkmalen des Kohlenhydratstoffwechsels angereichert, wie z. B. dem Galaktosestoffwechsel und dem Glyoxylat-/Dicarboxylatstoffwechsel, sowie einer Verstärkung der Glykanwege (ergänzende Abbildung 12A).

Die Tafeln a und b berichten über Unterschiede im Kohlenhydrat- und Aminosäurestoffwechsel vom PA- bis zum CA-Zeitraum. Panel c stellt einen Anstieg mehrerer Virulenzfaktoren im Laufe der Zeit dar, basierend auf der Klassifizierung von Chen et al.91. Proben (n = 71), geteilt durch Perioden, werden auf der x-Achse und die relative Häufigkeit auf der y-Achse angegeben. Boxplots sind wie folgt definiert: Minimal-, Maximal- und Mittelwerte stellen das 25-, 75- bzw. 50-%-Quantil dar; Der Median wird durch das 50 %-Quantil dargestellt. Obere und untere Whiskers sind die Maximal-/Minimalwerte von Daten, die innerhalb des 1,5-Interquartilbereichs über dem 75. bzw. unter dem 25. Perzentil liegen. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Mehrere signifikante Orthologe, die zu den Aminosäurewegen gehören, scheinen im Laufe der Zeit zuzunehmen, wie z. B. die Lysin-Biosynthese sowie die Glycin- und Cystein-Biosynthese, die in den LN- und CA-Proben eine höhere Häufigkeit erreichen (Abb. 4b).

Sogar im Vitaminstoffwechsel fanden wir signifikante Wege, die sich im Laufe der Zeit veränderten, insbesondere bei den B-Vitaminen (ergänzende Abbildung 12B). Unterschiede bei Enzymen, die Teil des Biosynthesewegs zu Cobalamin (Vitamin B12) in Bakterien sind, sind sowohl in den PA- als auch in den neolithischen Proben vorhanden. Kobalt-Precorrin-6B (K02191) und L-Threonin-Kinase (K16651) sind hauptsächlich in den PA-Proben vertreten, wobei die Tendenz besteht, mit der Zeit abzunehmen, während Percorrin-6Y C5,15-Methyltransferase (K00595) und Adenosylcobinamid-GDP-Ribazoltransferase (K02233) ) nehmen in den neolithischen Phasen zu. Neolithische Proben, insbesondere LN und CA, werden durch den Folatstoffwechsel sowie durch den Liponsäurestoffwechsel im Ein-Kohlenstoff-Pool angereichert; Liponsäure ist ein weiteres Vitamin des B-Komplexes, das offenbar die Virulenz und Pathogenität von Bakterien beeinflusst29.

Interessanterweise stellten wir in unserer neolithischen Kohorte einen allgemeinen Anstieg des Virulenzfaktors fest (Abb. 4c). KEEG-Orthologe, die an bakterieller Motilität, Immunevasion, Antiphagozytose und Endotoxinen beteiligt sind, erhöhten ihre relative Häufigkeit im Laufe der Zeit allmählich und erreichten ihre höchsten Werte in LN und CA. Die Arten, die zu den erhöhten Werten dieser Virulenzfaktoren beitrugen, waren P. gingivalis, T. forsythia, P. intermedia, Capnocytophaga ochracea und Fusobacterium nucleatum.

Insgesamt hatten, wie in der taxonomischen Analyse beobachtet, Probanden, die sowohl zu EN als auch zu MN gehörten, eine sehr ähnliche funktionelle Zusammensetzung (wie durch die explorative Clusteranalyse hervorgehoben), was eine Art Zwischenposition zwischen den beiden in der PA beobachteten, unterschiedlicheren Zuständen darstellte LN-CA-Proben.

Die neun Zahnsteinproben, die zu den Proben des oberen Paläolithikums (PA) gehörten, ergaben im Vergleich zu anderen nachgewiesenen Arten von Mikroresten hauptsächlich Stärkekörner, was einer Gesamtmenge von 215 einzelnen Stärkekörnern entspricht (Ergänzende Diskussion und Ergänzende Daten 8). Die Stärkekörner wurden hauptsächlich mit Poaceae und insbesondere mit wilden Triticeae und Avena cf. in Verbindung gebracht. Barbata (Hafer, vgl. schlanker Wildhafer). Schließlich wurden bestimmte Stärkekörner morphologisch als diejenigen des Rhizoms von Nuphar lutea (gelbe Seerose) identifiziert. Seerosenstärkekörner (keine gelbe Seerose) wurden auch im Zahnstein von Neandertalern gefunden30.

Für die Zeiträume Neolithikum und Kupferzeit wurden 18 Proben analysiert (Supplementary Data 8). Insgesamt wurden aus den Proben 25 Stärkekörner entnommen, die zu zwei Morphotypen gehörten. Körner vom Morphotyp I zeigten diagnostische Merkmale für die Körner vom Typ A der Triticeae-Stammart. Unter den zahlreichen Phytolithen wurden 16 längliche dendritische Epidermis geborgen. Solche Phytolithen im Zahnstein gelten normalerweise als direkter Beweis für den Getreidekonsum, da sie in den Blütenhüllblättern von Weizen- und Gerstenarten vorkommen31. Interessanterweise wurden zahlreiche Kieselalgen der Gattung Nitzschia geborgen, darunter viele Süßwasser- und Meeresarten, die im Allgemeinen verschmutzungstolerant sind32. Abschließend ist die Wiederherstellung von Pilzsporen von sieben Individuen aus der Jungsteinzeit und der CA-Zeit erwähnenswert. Einige der Sporen wurden als zu Glomus gehörend identifiziert, einer großen Pilzgattung, die mit Pflanzenwurzeln assoziiert ist33, während mehrere Hefesporen in zwei neolithischen Proben aus verschiedenen Fundorten identifiziert wurden, was wahrscheinlich auf den Verzehr fermentierter Lebensmittel schließen lässt.

Weitere Einzelheiten zur Mikrotrümmeranalyse finden Sie in der ergänzenden Diskussion.

Schließlich führten wir eine De-novo-Rekonstruktion durch, bei der mehrere MAGs zusammengestellt wurden, von denen das am häufigsten vorkommende als Olsenella sp. identifiziert wurde. orales Taxon 807 (Supplementary Data 9, Supplementary Abb. 13). Daher haben wir beschlossen, diese Art weiter zu untersuchen, sowohl weil sie in mehreren Proben aus verschiedenen neolithischen Phasen vorhanden ist, als auch weil sie bereits als möglicher mikrobieller Biomarker im Zusammenhang mit diesem Übergang beschrieben wurde16. Wie erwartet deutete die phylogenetische Analyse darauf hin, dass die alten Olsenella-Genome eng mit der modernen Referenz dieser Art verwandt sind, sie wurden jedoch in zwei verschiedene Cluster aufgeteilt: einer bestand aus vier Genomen, die aus den ältesten Proben rekonstruiert wurden, und der andere aus zwei CA Proben, die phylogenetisch näher an der modernen Referenz waren (Abb. 5a). Einige Regionen wurden in allen alten Genomen häufig übersehen (Abb. 5b) und könnten mit neueren Elementen der Evolution in Zusammenhang stehen. Insgesamt wurden in den alten Genomen insgesamt 123 Regionen dezimiert, die mehreren Proteinfamilien entsprachen (Ergänzende Abbildung 14 und Ergänzende Daten 10). Die meisten Teile dieser Regionen enthielten nur hypothetische Proteine. Zwei große Lücken, die sich bei ~1900 kbp und ~2200 kbp befanden, enthielten Proteinfamilien, die an Abwehrmechanismen und Interaktionen mit anderen mikrobiellen Kommensalen beteiligt sind: CRISPR-assoziiertes Protein, Antitoxin HigA, mobiles Element, Fic-Domänenproteine ​​und Integrase/Rekombinase sowie Tetracyclin Resistenzfamilie (TetR).

Panel a berichtet über die phylogenetische Analyse der sechs rekonstruierten alten Genome (hellblauer Kasten) zusammen mit 17 modernen Olsenella sp. Referenzen, durchgeführt von PATRIC100. In Panel b ist es möglich, die mit BRIG99 durchgeführte Alignment-Analyse zu beobachten. Der violette Kreis zeigt Olsenella sp. orale Taxon 807-Referenz, während die alten Genome durch den Code der Proben identifiziert werden, aus denen sie zusammengesetzt wurden.

Weitere Einzelheiten zur Genomrekonstruktion finden Sie in der ergänzenden Diskussion.

In den letzten Jahren ist durch gemeinsame Anstrengungen in den Bereichen Archäologie und Humangenetik ein detaillierteres Bild des antiken Europa entstanden34,35. Allerdings fehlen uns noch einige Steinchen im globalen Mosaik. Beispielsweise ist das Wissen über die Entwicklung des menschlichen Mikrobioms immer noch schwer fassbar und fragmentiert.

In der vorliegenden Studie haben wir die Entwicklung menschlicher Symbionten während der gesamten Jungsteinzeit verfolgt und das neolithische Mikrobiom mit dem der Jäger-Sammler-Populationen des Jungpaläolithikums und der darauffolgenden Kupferzeit verglichen. Wir beobachteten verschiedene Cluster, die bisher in der wissenschaftlichen Literatur nicht entdeckt wurden und durch spezifische orale mikrobielle Profile gekennzeichnet sind, die der chronologischen Entwicklung dieser Populationen folgen.

Die meisten der festgestellten Veränderungen im Artenreichtum im Laufe der Zeit könnten mit Verschiebungen in den Subsistenzstrategien (z. B. zwischen Jägern und Sammlern und der Landwirtschaft) oder mit Veränderungen in den Elementen, aus denen die neolithische Ernährung besteht, zusammenhängen. Eine erste Unterscheidung betrifft PA-Proben, deren Mikrobiome sich aus taxonomischer und funktioneller Sicht deutlich von den späteren neolithischen zu unterscheiden scheinen. Die Mikrobiome der analysierten Jäger-Sammler-Individuen sind sehr ähnlich, obwohl sie zu einem langen chronologischen Zeitraum gehören, der das letzte glaziale Maximum umfasst, und möglicherweise zu einem Populationsaustausch in der darauffolgenden Periode36,37. Dies kann als Ausdruck einer seit langem bestehenden ähnlichen Subsistenzstrategie angesehen werden, die auf einem erheblichen Verzehr von tierischem Eiweiß und Fett sowie stärkehaltigen Kohlenhydratnahrungsmitteln basiert, wie durch die Kombination der hier berichteten Mikroreste und funktionellen Ergebnisse mit zooarchäologischen Daten nahegelegt wird von der Paglicci-Höhle38,39. Die identifizierten Unterschiede in den Kohlenhydratwegen zwischen den PA- und neolithischen Proben hängen wahrscheinlich mit einer Variation bei den ausgewählten Kohlenhydratquellen zusammen. Tatsächlich ergab die Mikrorestanalyse einen höheren Grad an taxonomischer Variabilität der verbrauchten Stärkekörner in den PA-Proben im Vergleich zu den neolithischen Proben (siehe ergänzende Diskussion), was mit der höheren Häufigkeit des bakteriellen Stärkestoffwechselwegs übereinstimmt. Interessanterweise wurden Hinweise auf Stärkenachweise, die dem Hafer (Avena cf. barbata) zuzuordnen sind, sowohl im Zahnstein von fünf PA-Individuen (drei Gravettien und zwei Epigravettien) als auch auf einem Schleifstein gefunden, der in einer frühen Gravettienschicht derselben Fundstelle ausgegraben wurde der Paglicci-Höhle, was mehrere Beweisquellen für den Verzehr dieser Pflanze in allen betrachteten paläolithischen Phasen liefert38.

Umgekehrt waren die neolithischen Proben durch eine begrenzte Gruppe von Stärkekörnern während aller untersuchten neolithischen Phasen sowie durch verschiedene taxonomische und funktionelle Variablen im Zusammenhang mit dem Kohlenhydrat-, Vitamin- und Aminosäurestoffwechsel sowie Virulenzfaktoren gekennzeichnet.

Aus taxonomischer Sicht wurden mit Beginn des neolithischen Übergangs Arten, die zuvor während der PA nur unzureichend als pathogene Mitglieder der roten und orangen Komplexe nachgewiesen wurden, zusammen mit anderen Taxa (z. B. Olsenella sp. orales Taxon 807, Parvimonas micra, (unter anderem Desulfomicrobium orale und Filifactor Alocis) tauchten auf oder nahmen in ihrer Häufigkeit zu. Bakterienarten, die zu den roten und orangen Komplexen gehören, aggregieren zusammen und sind bekannte ätiologische Erreger von Parodontalerkrankungen27. Sie tragen mehrere Virulenzfaktoren (z. B. Fimbrien und Proteasen) mit proteolytischen Fähigkeiten, die das Bindegewebe des Wirts beeinflussen und eine Fehlfunktion der Immunantwort auslösen können40. Kürzlich wurde das Vorhandensein von P. gingivalis auch mit mehreren extraoralen Entzündungszuständen wie Herz-Kreislauf-Erkrankungen, Diabetes und Alzheimer in Verbindung gebracht und scheint einen direkten Einfluss auf die mikrobielle Zusammensetzung des Wirtsdarms auszuüben41,42,43. Daher beruht der beobachtete Anstieg der Virulenzfaktoren in allen neolithischen Phasen und insbesondere während der LN/CA-Perioden hauptsächlich auf der erhöhten Häufigkeit roter komplexer Arten. Insgesamt waren neolithische Proben auch durch das Vorhandensein eines Galaktosestoffwechsels gekennzeichnet, der wahrscheinlich mit dem Verzehr von Milchprodukten zusammenhängen könnte. Galaktose wird aus Laktose metabolisiert, einem Disaccharidzucker, dessen Hauptnahrungsquelle Milch und Milchprodukte sind44, die das Wachstum laktosefermentierender Bakterien stimulieren können45. Tatsächlich könnte die Identifizierung von Hefesporen anhand der Mikrotrümmeranalyse auf den Verzehr fermentierter Lebensmittel hinweisen, was mit einer Milchquelle in Zusammenhang stehen könnte. Der Beginn der Ausbeutung tierischer Sekundärprodukte wird im Allgemeinen für die Zeit nach dem Neolithikum berichtet46, der Milchkonsum begann jedoch viel früher, was auch durch Lipidrückstände auf Töpfen sowie durch archäozoologische Aufzeichnungen zeitgenössischer italienischer Stätten47 bestätigt wird. Mehrere taxonomische und funktionale Merkmale waren nicht gleichmäßig über die gesamte Jungsteinzeit verteilt, sondern es wurde ein deutlicher Unterschied zwischen der früheren und der späteren Phase festgestellt. Themen, die zum ersten Teil der Jungsteinzeit (d. h. EN und MN) gehören und den Kulturen Impressed Ware und Passo di Corvo entsprechen, weisen gemeinsame taxonomische und funktionale Elemente auf und weisen Merkmale auf, die zwischen den beiden Extremen PA und PA liegen LN-CA. Diese Erkenntnisse definieren die frühen Phasen als eine Art „Übergangszustand“, was den Mangel an starken Markern in früheren Analysen erklären könnte, die sich hauptsächlich auf den Beginn des landwirtschaftlichen Übergangs konzentrierten16,48. Darüber hinaus steht das vorgeschlagene Szenario im Einklang mit der Analyse stabiler Isotope, die zeigte, dass frühe Bauerngemeinschaften in Mittel- und Süditalien eine breite Palette an Nahrungsmitteln konsumierten, was eine Kontinuität mit früheren Jäger- und Sammlergemeinschaften zeigt26. Daher würde unser Ergebnis die Hypothese stützen, dass der Übergang zur neuen Subsistenzstrategie schrittweise und regional spezifisch erfolgte, mit einer starken Anpassung der ankommenden neolithischen Bevölkerung an die lokal verfügbaren Ressourcen, statt einer drastischen Umstellung auf eine homogene Ernährung, wie ebenfalls berichtet wurde durch Isotopen- und botanische Daten sowie Hinweise auf Kontinuität der kulinarischen Praktiken in anderen europäischen Regionen49,50,51. Der Standort Palagiano war der einzige, der ein hohes Maß an innerörtlicher Variabilität aufwies, die nicht mit irgendwelchen anthropologischen Metadaten (z. B. Alter, Geschlecht oder Pathologien) in Zusammenhang stand. Es ist jedoch bemerkenswert, dass archäologische Beweise auf die Existenz unterschiedlicher Bestattungsmodelle an derselben Stätte hinweisen, die als Ausdruck sozialer Differenzierung interpretiert wurden52. Wenn man bedenkt, dass die meisten Teile der Proben, die zu derselben Bestattung gehörten, laut taxonomischer Analyse im selben Cluster (C3) gruppiert waren, können wir annehmen, dass die hypothetischen sozialen Differenzierungen auf einen Unterschied im Ressourcenzugang oder in der Ernährungswahl hinweisen könnten.

Umgekehrt führten uns in der zweiten Hälfte der Jungsteinzeit mehrere taxonomische und funktionelle Merkmale zu der Annahme, dass eine Ernährungsweise mit hohem Kohlenhydrat- und niedrigem Proteingehalt eingeführt wurde. Das höhere Vorkommen von Capnocytophaga spp. sowie Ottowia HOT 894, Neisseria elongata und Rothia aerea, die alle in LN- und CA-Proben angereichert waren, wurde mit einem höheren Verbrauch an Ballaststoffen in Verbindung gebracht, sowohl im veganen Speichelmikrobiom als auch in das Plaque-Mikrobiom17,19. Darüber hinaus zeigt das orale Mikrobiom der modernen veganen Bevölkerung auch einen Anstieg spezifischer Aminosäurewege, wie der Lysin-, Glycin- und Cystein-Biosynthese, die selbst bei LN- und CA-Proben deutlich angereichert waren19. Das Vorhandensein dieser Merkmale deutet auf einen Anstieg der Kohlenhydrataufnahme innerhalb der LN/CA-Perioden hin und stimmt mit den durch Isotopenanalysen aufgezeichneten Daten überein, die einen abnehmenden Trend bei der tierischen Proteinaufnahme und einen Anstieg des pflanzlichen Proteinverbrauchs von EN zu LN und CA berichten. zusammen mit einer Intensivierung der landwirtschaftlichen Praktiken in süditalienischen Bauerngemeinden am Ende der Jungsteinzeit25,53. Darüber hinaus wurde in botanischen Aufzeichnungen immer während der LN-Periode eine Veränderung in der Auswahl der Kohlenhydratressourcen festgestellt, mit einer Verringerung der taxonomischen Variabilität von Getreide und Hülsenfrüchten und einer Zunahme dürretoleranter Pflanzen (z. B. Gerste und Einkornweizen – Hordeum spp. und). Triticum monococcum-)24. Diese Veränderung der landwirtschaftlichen Praktiken wurde mehr mit spezifischen Umweltbedingungen als mit kulturellen Entscheidungen in Verbindung gebracht, die mit dem Auftreten zweier trockener Klimaphasen zusammenhängen, die Süditalien zwischen der FMN- und der LN-Periode (4500-4000 v. Chr.) und während des Übergangs von der LN zur LN betrafen CA (4000–3500 v. Chr.)24 (Ergänzende Abbildung 15).

Durch die Kombination botanischer Aufzeichnungen mit den zitierten Isotopendaten und unseren Ergebnissen stellen wir daher die Hypothese auf, dass die Gründe für die Veränderung der mikrobiellen Zusammensetzung während des Spätneolithikums mit Veränderungen der Nahrungsbestandteile (z. B. Getreide und essbare Pflanzen) zusammenhängen könnten. Die lokale Bevölkerung nutzte diese Veränderungen wahrscheinlich, um mit trockeneren klimatischen Bedingungen zurechtzukommen, was sich möglicherweise auf die Verfügbarkeit der zuvor verzehrten Nahrungspflanzen ausgewirkt hat24. Die Ernährungsschwankungen, die sich auf die Kohlenhydrataufnahme auswirkten, veränderten letztendlich die Häufigkeit oraler Spezies und die mikrobielle Zusammensetzung der Plaque17.

Die orale mikrobielle Gemeinschaft der LN/CA-Proben weist die höchste Häufigkeit an Arten auf, die mit den roten und orangen Komplexen und an Virulenzfaktoren in Zusammenhang stehen, was darauf hindeutet, dass die oralen Ökosysteme der LN- und CA-Populationen einen schlechteren Gesundheitszustand hatten als die ihrer jüngsten Populationen Vorfahren. In diesem Zusammenhang ist es bemerkenswert, dass anthropologische Analysen, die hauptsächlich aus veröffentlichten Artikeln stammen (siehe Ergänzung. Diskussion), ergaben, dass die meisten der betrachteten Proben für LN- und CA-Zeiträume durch eine höhere Inzidenz oraler Erkrankungen gekennzeichnet waren. Im Gegensatz dazu zeigten die PA-Proben gute Mundgesundheitszustände, während die EN/MN-Proben eine geringe Inzidenz von Parodontitis und Karies aufwiesen (Ergänzungsdaten 1). Dieser Trend steht auch im Einklang mit früheren Studien zu Skelettresten, die bereits auf eine Verschlechterung der Mundgesundheit im Zusammenhang mit der Umstellung auf die Landwirtschaft hindeuteten54,55.

Unter Berücksichtigung zusätzlicher Aspekte des Gesundheitszustands der neolithischen Bevölkerung haben wir das Vorhandensein von Kieselalgen festgestellt, was auf den Verzehr von verschmutztem Wasser schließen lässt, was erhebliche Auswirkungen auf die menschliche Gesundheit gehabt haben könnte56.

Schließlich könnten weitere Faktoren, die die beobachteten Veränderungen in der Bakterienökologie erklären, mit der genetischen Variation während der Evolution des Symbiontengenoms zusammenhängen, die sich auf die Interaktion und Anpassung der Arten ausgewirkt haben könnte. Bakterien, die in derselben Gemeinschaft leben, teilen hauptsächlich negative Wechselwirkungen (z. B. Konkurrenz) statt positiver (z. B. Kooperation), insbesondere wenn sie in einer Umgebung mit hoher Artenvielfalt leben, in der die Konkurrenz um Nährstoffe stärker wird57. Antibakterielle Toxine sind zusammen mit anderen Virulenzfaktoren die Waffen, mit denen Arten konkurrieren und starke negative Wechselwirkungen zwischen ihnen hervorrufen58. Die Analyse der alten Olsenella sp. In den Genomen des oralen Taxons 807 wurden im Vergleich zu den modernen Genomen eine Reihe fehlender Elemente festgestellt, die hauptsächlich mit Virulenzfaktoren und der Bildung von Biofilmen zusammenhängen, was darauf hindeutet, dass sich seine Fähigkeit, mit anderen oralen Arten, die in derselben Nische leben, zu konkurrieren und zu interagieren, kürzlich weiterentwickelt hat. Zusammen mit dem stärkeren Selektionsdruck, der durch Ernährungsumstellungen entsteht, hätte dies letztendlich Auswirkungen auf die Ökologie des oralen Mikrobioms gehabt.

Zusammenfassend liefert unsere Analyse Belege für das Vorhandensein von zwei Hauptverschiebungen, die sich auf die Häufigkeit mehrerer Arten des oralen Mikrobioms in den untersuchten Populationen auswirken: (i) Die erste hängt mit dem kulturellen Wandel zusammen, der mit der Einführung des landwirtschaftlichen Lebensstils in dieser Region verbunden ist , was zu einer anfänglichen Änderung der Mikrobiomzusammensetzung führte und gleichzeitig einige Aspekte der vorherigen Jäger-Sammler-Proben beibehielt; (ii) die zweite Phase ereignete sich im Spätneolithikum und hängt wahrscheinlich mit der Anpassung an bestimmte Ernährungselemente zusammen, als die in der ersten Phase beobachteten Veränderungen stärker hervortraten und einige Arten, die bei den Jägern und Sammlern stark vertreten waren, fast verschwanden, wahrscheinlich aufgrund der fortschreitenden Anpassung der Landwirte an bestimmte Ernährungselemente.

In Absprache mit der örtlichen Aufsichtsbehörde für Kulturerbe wurden 79 Proben von mehreren archäologischen Stätten im selben geografischen Gebiet (Mittelsüditalien) auf der Halbinsel gesammelt, wo die Jungsteinzeit etwa 6200 v. Chr. begann. Um ein tiefgreifendes Verständnis der gesamten Jungsteinzeit zu erhalten, haben wir Proben gesammelt, die den gesamten Übergang von Anfang bis Ende abdecken und dabei den wichtigsten archäologischen und kulturellen Unterteilungen dieser Zeit folgen: frühes Neolithikum (EN, entspricht ungefähr die Impressed-Ware-Kultur, aus dem VII. bis VI. Jahrtausend v. Chr.), Mittelneolithikum (MN, entsprechend der bemalten Ware am Passo di Corvo, während des VI. Jahrtausends v. Chr.), letzter Teil des Mittelneolithikums (FMN, entsprechend der Serra d' Altbemalte Ware vom Ende des VI. Darüber hinaus haben wir sowohl die früheren Jäger-Sammler-Individuen aus demselben Gebiet am Standort der Paglicci-Höhle (PA, entsprechend den oberpaläolithischen Gravettien- und Epigravettien-Kulturkontexten) als auch die postneolithische Phase, die sogenannte Kupferzeit (CA, entsprechend Gaudo- und Laterza-Ware). Um möglichen Verzerrungen im Zusammenhang mit der oralen Biogeographie entgegenzuwirken, wurden, sofern verfügbar, hauptsächlich die molaren Zahnsteine ​​entnommen (Ergänzungstabelle 1)59. Weitere Informationen zur untersuchten archäologischen Stätte, zum kulturellen Hintergrund und zur Radiokarbondatierung finden Sie in der Ergänzungstabelle 1 und den Ergänzungsmethoden.

Die DNA-Extraktion und -Sequenzierung wurde an 76 Proben in einem speziellen aDNA-Reinlabor am Institut für Biologie der Universität Florenz (Italien) durchgeführt, wobei validierte Richtlinien zur Vermeidung moderner DNA-Kontaminationen befolgt wurden60. Nach der Dekontamination unter UV-Licht für 10 Minuten wurde der Zahnstein mit einem sterilen Mikrostößel grob gemahlen und gemäß Verfahren A von Modi et al.61 behandelt, das die gemeinsame Analyse von genetischem Material und Lebensmittelrückständen aus derselben Zahnsteinprobe ermöglicht. Kurz gesagt, nach dem Verdau über Nacht in 1 ml Extraktionspuffer (0,45 M EDTA pH 8,0, 0,25 mg/ml Proteinase K, 0,05 % Tween 20) wurden die restlichen Pellets für die Mikrorestanalyse gelagert, während die DNA mit einer speziellen Silica-Spin-Säule extrahiert wurde Protokoll zur Gewinnung kurzer Moleküle62. Nach 2-minütiger Zentrifugation bei maximaler Geschwindigkeit wurde der Überstand mit 10 ml Bindungspuffer (5 M Guanidinhydrochlorid, 0,05 % Tween 20, 40 % 2-Propanol) und 400 µL 3 M Natriumacetat pH 5,2 in Silica-Säulen (High) inkubiert Pure Viral Nucleic Acid Large Volume Kit, Roche Diagnostic – Mannheim, Deutschland). Nach zwei Waschschritten mit Waschpuffer (High Pure Viral Nucleic Acid Large Volume Kit, Roche Diagnostic – Mannheim, Deutschland) wurde die DNA zweimal in 50 µL TET-Puffer (1 mM EDTA pH 8,0, 10 mM Tris-HCl pH 8,0, 0,05 % Tween 20). Zwanzig Mikroliter jedes Extrakts wurden dann in doppelt indizierten Illumina-Bibliotheken63,64 ohne Behandlung mit Uracil-DNA-Glykosylase (UDG) umgewandelt, um fehlerhafte Nukleotideinbauten beizubehalten. An beiden Enden jedes Bibliotheksmoleküls wurde durch 10 PCR-Zyklen eine einzigartige Kombination aus zwei 8 Basen langen Indizes hinzugefügt. Das gesamte Bibliotheksvolumen wurde in 4 Reaktionen aufgeteilt und als Matrizen in 100-µl-PCR-Reaktionen verwendet, die 1x Pfu-Reaktionspuffer, 2,5 U Pfu-Turbo-DNA-Polymerase (Agilent Technologies – Santa Clara CA, USA), jeweils 250 µM dNTP und jeweils 200 nM enthielten Indexierungsprimer (P5-Primer: AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACxxxxxxxxACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTT; P7-Primer: CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATxxxxxxxGTGACTGGAGTTCAGACGTGT). Die Zyklusbedingungen bestanden aus einem Aktivierungsschritt von 2 Minuten Dauer bei 95 °C, gefolgt von 10 Denaturierungszyklen bei 95 °C für 30 Sekunden, Tempern bei 58 °C für 30 Sekunden und Elongation bei 72 °C für 1 Minute, mit a Letzter Verlängerungsschritt bei 72 °C für 10 Minuten. PCR-Produkte wurden mit dem MinElute PCR Purification Kit (QIAGEN – Hilden, Deutschland) gereinigt und in 25 µl TET-Puffer eluiert. Nach einer qualitativen und quantitativen Überprüfung mit Agilent TapeStation (D1000 ScreenTape und Reagenzien, Agilent Technologies – Santa Clara, CA, USA) wurden Bibliotheken in äquimolaren Mengen gepoolt und auf einer Illumina NovaSeq 6000-Plattform im Paired-End-Modus mit 2 × 51+ sequenziert 8 + 8 Zyklen65.

Die mikroskopische Analyse wurde an 27 Proben vom Labor für Palinologie der Universität Florenz für die paläolithischen Proben und vom DANTE-Diet- und ANcient TEchnology-Labor der Sapienza-Universität Rom für die neolithischen und kupferzeitlichen Proben durchgeführt. Basierend auf unserer Erfahrung ist es möglich, die Mikroreste ausgehend vom Probenpellet, das zur Extraktion von aDNA verwendet wird, in einem ordnungsgemäß sauberen Labor zu entnehmen und zu analysieren61. Darüber hinaus wurden sechs Proben auf beide Quellen (Zahnstein und Pellet) analysiert, um die erhaltenen Ergebnisse weiter zu vergleichen.

Die Probenahme von Zahnstein erfolgte nach dem von Sabin und Fellow Yates66 systematisierten Protokoll mit einigen Abweichungen (z. B. wurden Einwegklingen nach jeder Probenentnahme gewechselt). Extraktions- und Dekontaminationsverfahren folgten veröffentlichten Standardprotokollen66,67,68 und wurden in speziellen Reinräumen durchgeführt, die nicht mit modernen botanischen Arbeiten in Verbindung standen, und unter strenger Umweltüberwachung. Die Reinigung wurde täglich durchgeführt, um jede Art moderner Kontamination zu verhindern. Die Oberflächen der Labortische wurden vor der Analyse jeder Probe mit Seife und Ethanol gereinigt, mit Aluminiumfolie abgedeckt und stets saubere, stärkefreie Nitrilhandschuhe getragen. Die Zahnsteinreinigung wurde unter einem Stereomikroskop auf einer zuvor gewaschenen Petrischale mit bis zu 100-facher Vergrößerung durchgeführt. Die Entfernung mineralisierter Verschmutzungen, die an der Oberfläche des Zahnsteins hafteten, wurde sorgfältig durchgeführt, wobei eine sterile Pinzette zum Halten der Probe und eine feine Akupunkturnadel zum sanften Abkratzen der an der Außenschicht der mineralisierten Plaque haftenden Verschmutzungen verwendet wurden. Das Verfahren wurde mit Tropfen von 0,5 M HCl-Säure durchgeführt, um die mineralisierten Bodenflecken aufzulösen, und mit hochreinem Wasser, um die Entmineralisierung zu blockieren sowie die Verunreinigungen zu waschen und zu entfernen. Der entfernte mineralisierte Boden wurde zur Überwachungsanalyse in Kunststoffröhrchen gelagert. Anschließend wurde der saubere Zahnstein bis zu dreimal in hochreinem Wasser gewaschen, um alle Spuren von losem Sediment zu entfernen, in einer Lösung von 0,5 M HCl gelöst und anschließend mit einer Lösung aus 50:50 Glycerin und hochreinem Wasser auf Objektträger montiert. Darüber hinaus wurden Kontrollproben von den sauberen Arbeitstischen und Staubfallen gesammelt und zu Vergleichszwecken analysiert, um jede Art moderner Kontamination zu verhindern. Dies ist eine Praxis, die in unseren Labors routinemäßig durchgeführt wird, auch wenn keine archäologischen Analysen durchgeführt werden, um ein besseres Verständnis des Kontaminationsflusses im Laufe der Jahreszeiten zu ermöglichen. Wir haben keine Trümmer geborgen, die morphologisch den Überresten in den Umweltkontrollproben ähnelten. Stärkekörner machten einen sehr geringen Anteil des Laborstaubs aus. Die Pellets wurden 12 Stunden lang mit 10 % HCl behandelt und in eine 50 % Vol./Vol. Wasser-Glycerin-Lösung gegeben. Die Analyse erfolgte unter Lichtmikroskopie, unter Hellfeldlicht und kreuzpolarisiertem Licht. In der Zahnsteinmatrix und im Pellet eingebettete Mikrotrümmer wurden mit einem Zeiss Imager2 bei Vergrößerungen im Bereich von 100-fach bis 630-fach analysiert.

Für die Identifizierung archäologischer Stärkekörner wurde eine moderne Referenzsammlung von 300 im Mittelmeerraum und Europa heimischen Pflanzen zusammen mit der veröffentlichten Literatur sowie dem Herbarium Centrale Italicum (FI) und Proben aus dem Botanischen Garten der Universität verwendet von Florenz30,38. Sporen wurden durch Vergleich mit der verfügbaren Literatur69 identifiziert. Die Körnergruppen wurden als vorhanden gezählt. Die Phytolith-Nomenklatur entsprach ICBN 2.0.

Metagenomische Sequenzen wurden hinsichtlich ihrer Qualität verarbeitet, und die Adaptersequenzen wurden gekürzt und Paired-End-Lesevorgänge wurden mit der Software AdapterRemoval (v2.2.0)70 mit den folgenden Optionen reduziert: -minlength 30 –minquality 25 –trimns –trimqualities –collapse. Anschließend wurden Sequenzduplikate mit Prinseq71 (Version 0.19.1) (https://prinseq.sourceforge.net/) entfernt und mit Kraken2 (Version 2.0.8-beta) zur taxonomischen Identifizierung analysiert72. Wir haben eine benutzerdefinierte Datenbank mit bakteriellen, viralen, archaealen und mitochondrialen Genomen aus der NCBI Reference Sequence (RefSeq)-Datenbank (https://www.ncbi.nlm.gov/refseq/) erstellt, die auf Dezember 2020 aktualisiert wurde. Um eine falsche Klassifizierung zu vermeiden, haben wir die Referenzgenome für Regionen mit geringer Komplexität mit Dustmasker (v.1.0.0) maskiert (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK569845/). Die Ausgabe von Kraken2 wurde dann mit der Bracken-Software (Version 2.5) analysiert, um die Lesehäufigkeit der Arten abzuschätzen73 (Ergänzungsdaten 11). Derselbe Ansatz wurde für die metagenomischen Referenzproben moderner und alter Mikrobiome verwendet, die für explorative Vergleichsanalysen verwendet und in der Ergänzungstabelle 3 aufgeführt sind. Wir haben die Arten ausgewählt, die im gesamten Datensatz in einer relativen Häufigkeit von mehr als 0, 02 vorhanden waren. Diese Art von taxonomischem Filter wird befürwortet, um den möglichen Einfluss von im Datensatz vorhandenen Arten mit geringer Häufigkeit und Singletons zu verringern, und er ist besser geeignet als der klassische Verdünnungsansatz74,75. Dank des angewandten Schwellenwerts haben wir 49 Arten erhalten, deren Desaminierungsprofil anschließend validiert wurde und die somit ihr Alter bestätigen. Wir haben jede Probenablesung mit ihren jeweiligen Referenzgenomen abgeglichen, die in der NCBI RefSeq-Datenbank hinterlegt sind, und dabei nur die Arten verwendet, die als „Referenz“ oder „Repräsentant“ gemeldet wurden. Zu diesem Zweck wurde das Programm Burrows-Wheeler Alignment (BWA v.0.7.15)76 verwendet, das den Aln-Algorithmus mit hoher Stringenz (-n 0,1) verwendete. Ausgerichtete Sequenzen wurden dann mit PMDtools (v.0.60) (–threshold 1 –requiremapq=30) (https://github.com/pontussk/PMDtools) auf ihr Cytosin-Desaminierungsprofil untersucht. Für jede der ausgerichteten Arten haben wir die BAM-Dateien mit Bedtools (https://bedtools.readthedocs.io/en/latest/) ins Bett konvertiert und die Bearbeitungsentfernung (-tag NM) geschätzt, die anschließend zur Berechnung der verwendet wurde Bearbeiten Sie den Distanzalgorithmus (–Δ%), um die Authentizität der Sequenz weiter zu bestätigen77. Wie bereits berichtet, haben wir –Δ% > 0,8 als authentisch bewertet, um mögliche horizontale Übertragungsereignisse oder das Vorhandensein genetisch eng verwandter Arten im Mikrobiom der Proben zu beurteilen78. Alle Informationen zum Desaminierungsprofil und –Δ % für jede Art und alle Proben sind in der Ergänzungstabelle 4 aufgeführt. Wir haben den Fragmentierungsgrad und die Unterschiede im Desaminierungsprofil in allen hier untersuchten Zeiträumen weiter ausgewertet, um das zu beobachten Auswirkung taphonomischer Ereignisse im Zeitverlauf (Ergänzende Abbildungen 4 und 5).

Um das Ausmaß einer möglichen modernen Kontamination zu untersuchen und die oralen Quellen unserer alten Proben zu authentifizieren, haben wir die erhaltenen Mikrobiomprofile mit denen moderner und alter metagenomischer Proben verglichen. Moderne Mikrobiome aus Fäkalien, Boden, Haut und Mund (sowohl Zahnstein als auch Plaque) wurden aus dem Europäischen Nukleotidarchiv abgerufen, während neue Umwelt- und Laborkontrollen erstellt wurden (Ergänzungstabelle 3). Zwei Bodenproben, die direkt in den Regionen Apulien und Marken entnommen wurden, und mit zwei Laborkontrollen (dh aus den Extraktions- und Sequenzierungsprozessen). Darüber hinaus wurden bereits früher berichtete alte orale Mikrobiome aus anderen Studien als weitere Kontrollen hinzugefügt. Wir untersuchten die Positionen unserer Proben in Bezug auf moderne und antike Referenzen durch eine nichtmetrische mehrdimensionale Skalierung von Bray-Curtis-Abständen, basierend auf der Artenverteilung mit dem Paket phyloseq (v.1.30.0) aus der R-Software (v. 3.6.3) ( Ergänzende Diskussion). Darüber hinaus haben wir den Prozentsatz der oralen Quelle in unserem Datensatz mithilfe von Sourcetracker (https://github.com/danknights/sourcetracker) geschätzt und dabei eine Teilmenge moderner Mikrobiome berücksichtigt, die mithilfe der Illumina-Plattform aus Schrotflinten-Metagenomen gewonnen wurden und über 10 Millionen verfügen liest sich als Quellen (SI, ergänzende Abbildung 2). Für die Analyse wurden Proben zurückbehalten, die einen hohen Anteil oraler Quellen (>75 %) aufwiesen. Um mögliche Kontaminanten zu eliminieren, vergleichen wir schließlich die identifizierten Arten mit der Human Oral Microbiome Database (HOMD), um die Auswahl bekannter menschlicher oraler Arten sicherzustellen. In diesem Sinne war die einzige fragliche Art Burkholderia pseudomallei, ein Umweltbakterium und Erreger der Melioidose beim Menschen79. Die Gattung Burkholderia wurde in der menschlichen Mundhöhle und im Zahnbelag nachgewiesen80,81, es wurden jedoch bisher keine Hinweise auf B. pseudomallei für Zahnstein beschrieben, daher können wir nicht ausschließen, dass sein Vorkommen mit einer alten Kontamination in Zusammenhang stehen könnte oder nicht.

Die Bracken-Ausgabe wurde verwendet, um die Artenverteilung zwischen Proben mithilfe der R-Software (Version 3.6.3) zu untersuchen. Zunächst wurden die Daten durch eine von Aitchison eingeführte zentrierte Log-Ratio-Transformation (clr) unter Verwendung des microViz-Pakets (v.0.9.0) normalisiert. Durch diese Transformation werden die Daten symmetrisch, skaleninvariant und linear verknüpft, sodass die Daten in einen logarithmischen Koordinatenraum eingeordnet werden82. Dieser Ansatz ist einer der am besten geeigneten zur Normalisierung von Zusammensetzungsdaten83. Um die Existenz möglicher Gruppen innerhalb unserer Kohorte durch einen unbeaufsichtigten Ansatz zu untersuchen, haben wir die Lückenstatistik auf Gattungsebene durchgeführt, eine Standardmethode, die die Anzahl der Cluster in einem Datensatz bestimmt84. Wir haben die clusGap-Funktion aus dem Cluster-Paket (v.2.1.0)85 angewendet, um die Güte des Clustermaßes für ein Phyloseq-Objekt (v.1.30.0)86 mit einem Bootstrap von 100 zu berechnen. Dann haben wir NetCoMi (v .1.0.2)87 um ein Netzwerk zu generieren, um die zwischen Stichproben gemeinsame Beziehung zu untersuchen, basierend auf der Aitchison-Distanz auf Gattungsebene, die für die Teilmenge und Aggregation der Daten stabiler ist und eine echte lineare Distanz darstellt83. Die Daten wurden mit dem k-Nearest-Neighbor-Algorithmus (k-nn) sparsifiziert und eine hierarchische Clusteranalyse unter Verwendung der Durchschnittsverknüpfungsmethode und des durch die Lückenstatistik erhaltenen k-Werts angewendet (Methode = „Durchschnitt“, k = 5). Wir nutzten die Netzwerkanalyse, um die Verbindungen zwischen den Proben hervorzuheben (nicht nur ihre Entfernung), und identifizierten vorhandene Cluster anhand der Mikrobiomzusammensetzung der Proben. Um diesen Ansatz mit einer klassischeren Analyse weiter zu untermauern, führten wir PCoA unter Verwendung der Aitchison-Distanz durch und führten PERMANOVA und ANOSIM durch, um die durch das Netzwerk identifizierte Clusterunterteilung zu validieren; Wir haben auch den möglichen Einfluss von Lesezahlen, Extraktion und Bibliotheksstapel überprüft. Wir haben paarweise Adonis (https://github.com/pmartinezarbizu/pairwiseAdonis) angewendet, um die Unterschiede zwischen Clusterpaaren hervorzuheben.

Um zu verstehen, welche der wenigen verfügbaren Metadaten (d. h. Zeitraum, Ort, Sterbealter oder Geschlecht) möglicherweise eine wichtige Rolle bei der Clusterunterscheidung gespielt haben, haben wir eine Random-Forest-Klassifizierung mit 100 Bäumen unter Verwendung des Radiant-Pakets ( v.1.4.0) (https://github.com/radiant-rstats/docs). Random Forest identifizierte den relativen Einfluss jedes Features auf das erstellte Modell, um das Clusterergebnis zu klassifizieren. Um das aus der Random-Forest-Analyse erhaltene Klassifizierungsmodell zu validieren, haben wir einen Assoziationstest mit der Assoc-Funktion aus dem vcd-Paket (Version 1.4-9) durchgeführt, die den Chi-Quadrat-Wert (X2) von Pearson berechnet, der die Abweichung von bewerten soll ein Unabhängigkeitsmodell in kategorialen Daten.

Um die Arten zu erforschen und zu identifizieren, deren Häufigkeit sich im Laufe der Zeit erheblich verändert hat, haben wir einen doppelten Ansatz gewählt. Wir haben die Clusterzusammensetzung mit DESeq2 (v.1.26.0) verglichen und dabei nur die Arten als signifikant akzeptiert, die einen angepassten p < 0,05 zeigten und bei mehr als einem Vergleich Signifikanz zeigten, um mögliche falsche signifikante Ergebnisse zu vermeiden. Um dann die stärksten Assoziationen von Arten mit Clustern und Periodenvariablen hervorzuheben, führten wir eine multivariate Analyse mit einem linearen Modell durch (MaAsLin v.1.0). Dieser statistische Rahmen wendet ein allgemeines lineares Modell an, um die Zusammenhänge zwischen klinischen Metadaten und mikrobiellen Taxa zu ermitteln, und wird in modernen epidemiologischen Studien häufig verwendet88. Für diese Analyse wurden folgende Parameter angewendet: eine maximale Falscherkennungsrate (Signifikanzschwelle) von 0,05; ein Minimum für die Filterung der relativen Häufigkeit von Merkmalen gleich 0,001; ein Minimum für die Merkmalsprävalenzfilterung von 0,01. Unterschiedlich häufig vorkommende Arten wurden auf der Grundlage ihrer Zugehörigkeit zu den ökologischen Komplexen, die die orale mikrobielle Gemeinschaft bildeten, neu gruppiert27.

Zusätzlich zum taxonomischen Profil haben wir durch eine mit HUMAnN 2.089 durchgeführte Analyse des Geninhalts bewertet, ob Veränderungen in der Mikrobiomzusammensetzung mit Unterschieden im Funktionsprofil korrespondieren könnten. Wir haben das Gengehaltsprofil in unseren Proben bewertet und sie mithilfe von UniRef90_ko neu gruppiert. Um eine Verzerrung des Gengehalts im Zusammenhang mit modernen Schadstoffen zu vermeiden, wurden die erhaltenen Profile gefiltert und die Arten ausgewählt, bei denen zuvor bestätigt wurde, dass sie authentisch alt sind. Wir verglichen die erhaltenen KEGG-Orthologenverteilungen (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) mit LEfSe (v.1.0)90 und wählten nur Ergebnisse mit p < 0,05 und LDA größer als 2 aus. In Bezug auf die Identifizierung des Virulenzfaktors (VF) wurden Gene erkannt als signifikant eingestuft wurden, wurden mit einer benutzerdefinierten Datenbank abgeglichen, die Informationen aus der von Chen et al. erstellten Virulence Factor Database (VFDB) enthielt.91.

Insgesamt wurden Diagramme mit ggplot2 (v.3.3.5)92 und einer farbenblinden Palette93 erstellt.

Die Rekonstruktion eines alten oralen Genoms erfolgte nach dem Vorbild von Wibowo et al. Pipeline9 für die Contigs-Validierung. Jedes Beispiel wurde mit SPAdes94 (v.3.15.3) mit der Option --meta zusammengestellt. Jede Stichprobe wurde mit Bowtie2 (v.2.3.5.1)95 mit den Standardeinstellungen den relativ zusammengesetzten Contigs zugeordnet. Die Ausgaben wurden mit SAMtools (v.1.9)96 indiziert und sortiert und die generierten BAM-Dateien wurden mit MetaBAT 2 (v.2.12.1)97 sequentiell in Bins unterteilt. Eine Bewertung der Assemblierungsqualität wurde über einen linienspezifischen Arbeitsablauf in CheckM (v.1.1.6)98 durchgeführt, wobei Genomvollständigkeit, Kontaminationsniveau, Abdeckung, N50-Werte, mittlere Contig-Länge und Größe des größten Contigs getestet wurden (siehe Ergänzungstabelle). S5). Die zusammengestellten Contigs wurden dann zur taxonomischen Identifizierung mit Kraken2 verwendet. Für die folgende Analyse wurden nur Genome mit einem Vollständigkeitsgrad von mehr als 85 %, einem Kontaminationsgrad <5 % und einer taxonomischen Identifizierung >95 % berücksichtigt. Um schließlich das aDNA-Schadensprofil zu bewerten, wurde das Skript Damageprofiler.sh von Wibowo et al. wurde verwendet, aber der letzte Teil des Skripts wurde mit PMDtools geändert. Eine Darstellung des Desaminierungsprofils für jede Probe ist in der ergänzenden Abbildung 13 dargestellt. Der Contigs-Abgleich mit der Referenz wurde mit BLAST Ring Image Generator (BRIG) (v.0.95)99 durchgeführt, wobei obere und untere Identitätsschwellenwerte von 70 % und 30 verwendet wurden %, jeweils. Mit dieser Software wurden sowohl Abb. 5 als auch die ergänzende Abb. 14 erstellt. Letztere enthält die von der NCBI-Datenbank abgerufene genetische Referenzanmerkung.

Die Contigs wurden dann zur weiteren Annotation, Phylogenetik und Proteomanalyse auf PATRIC (v.3.6.12)100 hochgeladen. Insbesondere wurden alle sechs rekonstruierten Genome im PATRIC-Arbeitsbereich mithilfe von RASTtk101 hinsichtlich ihrer genomischen Merkmale mit Anmerkungen versehen. Der phylogenetische Baum wurde mit RAxML (v.8.2.11)102 unter Verwendung von 23 modernen Genomreferenzen und 159 Genen erstellt. Anschließend wurde ein Proteom-Vergleichstool eingesetzt, um die Ähnlichkeit alter Proteine ​​mit der Mutterreferenz zu untersuchen und Funktionen und fehlende Regionen zu identifizieren. Es verwendet den BLASTP-Algorithmus, um Proteinsequenzen im Vergleich zum Referenzgenom entweder als einzigartig, als unidirektionaler Best-Hit oder als bidirektionaler Best-Hit zu vergleichen. Das Protein Family Sorter-Tool wurde verwendet, um die Verteilung von Proteinfamilien, die die Gattungsgrenze überschreiten (PGFs), unter alten Proben im Hinblick auf die moderne Referenz zu untersuchen.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Alle für diese Studie generierten Sequenzdaten wurden im NCBI Sequence Read Archive (SRA) unter BioProject PRJNA791766 hinterlegt. Verarbeitete Daten, Mikroskopiedaten sowie Genomassemblierungs- und Annotationsdaten sind im Papier und seinen Zusatzdatendateien enthalten. Archäologische Proben wurden bei der „Superintendenz für Archäologie, Bildende Kunst und Landschaft der Metropole Bari“ in Bari (Italien) und bei der „Superintendenz für Archäologie, Bildende Kunst und Landschaft der Provinzen Barletta-Andria-Trani und Foggia“ gesammelt " in Foggia (Italien), an der „Superintendenz für Archäologie, Bildende Kunst und Landschaft der Marken“ in Ancona (Italien), am „Museo delle Origini“ an der Universität „La Sapienza“ in Rom (Italien) und bei das Museum „Museo der Zivilisationen“ in Rom (Italien). Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

Der Code ist unter https://github.com/AndreaQ7/HuME und unter Zenodo103 (https://doi.org/10.5281/zenodo.7198970) verfügbar.

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Referenzen herunterladen

Wir danken Dr. Matteo Tuzzato für seine Unterstützung bei den Servern. Wir danken den Archäologen und Anthropologen der „Soprintendenza Archeologia, Belle Arti e Paesaggio per la Città metropolitana di Bari“, der „Soprintendenza Archeologia, Belle Arti e Paesaggio per le Province di Barletta-Andria-Trani e Foggia“ und der „Soprintendenza“. Archeologia, Belle Arti e Paesaggio delle Marche“, die eine fruchtbare Zusammenarbeit eingegangen sind. Wir danken A. Palma di Cesnola für seine Forschungen in der Grotta Paglicci und G. Capecchi für seinen Beitrag zur Organisation der menschlichen Überreste. Wir danken auch den Mitarbeitern des SMA – Museo di Storia Naturale di Firenze (Herbarium Centrale Italicum und Botanischer Garten) für die Bereitstellung von Referenzmaterialien. Dieses Projekt wurde durch das STARS 2019-Programm der Universität Padua bis AQ (Italien) finanziert. Die am Institut für Biologie der Universität Florenz durchgeführten Analysen wurden durch ein internes Stipendium der Universität Florenz finanziert (Progetto strategischo di Ateneo anno 2014 Nr. 129323 am 10.05.2015, zugewiesen an ML). Die Analyse der Mikrotrümmer im neolithischen Zahnstein wurde vom Europäischen Forschungsrat (ERC) im Rahmen des Rahmenprogramms Horizont 2020 gefördert (Starting Grant Project HIDDEN FOODS-Fördervereinbarung Nr. 639286 an die EC).

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Italo Maria Muntoni, Martina Lari.

Abteilung für vergleichende Biomedizin und Lebensmittelwissenschaft, Universität Padua, Legnaro, 35020, Italien

Andrea Quagliariello, Gabriel Innocenti und Maria Elena Martino

Abteilung für Biologie, Labor für Molekulare Anthropologie und Paläogenetik, Universität Florenz, Florenz, 50122, Italien

Alessandra Modi, Valentina Zaro, David Caramelli und Martina Lari

Abteilung für Antike Wissenschaften, Universität „Sapienza“ Rom, Rom, 00185, Italien

Cecilia Conati Barbaro

Abteilung für Physikalische, Erd- und Umweltwissenschaften, UR Urgeschichte und Anthropologie, Universität Siena, Siena, 53100, Italien

Annamaria Ronchitelli, Francesco Boschin und Stefano Ricci

Abteilung für Geschichte, Kulturen und Zivilisationen, Universität Bologna, Bologna, 40126, Italien

Claudius Cavazzuti

ABAP-Superintendenz für die Metropole Bari, Bari, 70121, Italien

Elena Dellù & Francesca Radina

Abteilung für Bioarchäologie – Museum der Zivilisationen, Rom, 00144, Italien

Alessandra Sperduti & Luca Bondioli

Abteilung für Asien, Afrika und das Mittelmeer, Universität „L'Orientale“ Neapel, Neapel, Italien

Alessandra Sperduti

Abteilung für Kulturerbe, Universität Padua, Padua, 35139, Italien

Luca Bondioli

Abteilung für Biologie, Labor für Palynologie, Universität Florenz, Florenz, 50121, Italien

Miriam Lognoli und Marta Mariotti Lippi

Abteilung für Biologie, Geologie und Umweltwissenschaften, Universität Bologna, Bologna, 40126, Italien

Maria Giovanna Belcastro und Valentina Mariotti

DANTE – Labor für Ernährung und antike Technologie, Abteilung für Kiefer- und Gesichtswissenschaften, Universität „Sapienza“ Rom, Rom, 00161, Italien

Emanuela Cristiani

Oberaufsicht für Archäologie, Bildende Kunst und Landschaft der Provinzen Barletta – Andria – Trani und Foggia, Foggia, 71121, Italien

Italo Maria Muntoni

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AQ, IMM und ML haben die Studie konzipiert. AQ und AM sammelten die Zahnsteinproben. AM und VZ führten unter Aufsicht von MLAQ die DNA-Extraktion und -Sequenzierung durch und GI führte die bioinformatische Analyse durch. MML, EC und M.Lo. führte die Analyse von Mikroresten durch. CC, ED, FR, AS, LB, MGB und VM führten die Untersuchung menschlicher Überreste aus verschiedenen neolithischen und kupferzeitlichen Stätten durch. IMM und CCB sind die wissenschaftlichen Verantwortlichen für die archäologischen Stätten der Jungsteinzeit und der Kupferzeit. AR und FB sind die wissenschaftlichen Verantwortlichen für die Forschung in der Paglicci-Höhle. SR führte die anatomische Identifizierung und Untersuchung menschlicher Überreste aus der Paglicci-Höhle durch. AQ, AM, EC, MML und ML haben das Papier mit Unterstützung von VZ, CCB, AR, FB, DC, MEM und IMM verfasst. Alle Autoren haben das Manuskript überarbeitet und genehmigt.

Korrespondenz mit Andrea Quagliariello oder Alessandra Modi.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Nature Communications dankt Nicolas Rascovan und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht durch gesetzliche Vorschriften zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Quagliariello, A., Modi, A., Innocenti, G. et al. Alte orale Mikrobiome unterstützen die allmähliche Umstellung der neolithischen Ernährung auf die Landwirtschaft. Nat Commun 13, 6927 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-34416-0

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Eingegangen: 3. März 2022

Angenommen: 25. Oktober 2022

Veröffentlicht: 22. November 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-34416-0

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