Variation des menschlichen Metaboloms entlang des oberen Darmtrakts

Nature Metabolism Band 5, Seiten 777–788 (2023)Diesen Artikel zitieren

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Der Großteil der Verarbeitung der menschlichen Nahrung findet im Dünndarm statt. Metaboliten im Dünndarm stammen aus Wirtssekreten sowie dem aufgenommenen Exposom1 und mikrobiellen Transformationen. Hier untersuchen wir die räumlich-zeitliche Variation des Lumeninhalts im oberen Darm während der routinemäßigen täglichen Verdauung bei 15 gesunden männlichen und weiblichen Teilnehmern. Hierzu verwenden wir ein nicht-invasives, einnehmbares Probenahmegerät, um 274 Darmproben und 60 entsprechende Stuhlhomogenate zu sammeln und zu analysieren, indem wir fünf Massenspektrometrie-Assays2,3 und 16S-rRNA-Sequenzierung kombinieren. Wir identifizieren 1.909 Metaboliten, darunter Sulfonlipide und Fettsäureester von Hydroxyfettsäuren (FAHFA). Wir beobachten, dass sich Stuhl- und Darmmetabolome dramatisch unterscheiden. Lebensmittelmetaboliten zeigen Trends bei ernährungsphysiologischen Biomarkern, einen unerwarteten Anstieg der Dicarbonsäuren entlang des Darmtrakts und einen positiven Zusammenhang zwischen luminalen Ketosäuren und der Obstaufnahme. Die größten interindividuellen Unterschiede sind auf ernährungsbedingte und mikrobiell verknüpfte Metaboliten zurückzuführen. Bemerkenswerterweise zeigten zwei Personen, die innerhalb von 6 Monaten vor der Probenahme Antibiotika eingenommen hatten, große Unterschiede in den Konzentrationen bioaktiver FAHFAs und Sulfonlipide sowie anderer mikrobiell verwandter Metaboliten. Aufgrund der interindividuellen Variation identifizieren wir Blautia-Arten als Kandidaten für eine Beteiligung am FAHFA-Metabolismus. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die nicht-invasive In-vivo-Probenahme des menschlichen Dünndarms und des aufsteigenden Dickdarms unter physiologischen Bedingungen Zusammenhänge zwischen Ernährung, Wirt und mikrobiellem Stoffwechsel aufdeckt.

Unser Ziel war es, metabolische Unterschiede zwischen Lumenproben aus dem oberen Darmtrakt von 15 gesunden Personen umfassend zu untersuchen, um das Ausmaß der räumlichen und zeitlichen Variation besser zu verstehen und die Aussichten für die Integration von Metabolom- und Mikrobiomdaten abzuschätzen. In einer verwandten Begleitpublikation4 verwenden wir diese Geräte, um Variationen entlang des Darms in der Zusammensetzung der Mikrobiota, der Prophageninduktion, dem Wirtsproteom und der mikrobiellen Modifikation von Gallensäuren zu untersuchen. Pro Probenahmezeitpunkt schluckten die Freiwilligen Sätze von vier Probeentnahmegeräten. Diese einnehmbaren Probenahmegeräte bestanden aus einer kollabierten Sammelblase, die mit einem Einwegventil in einer Kapsel mit einer pH-empfindlichen Beschichtung verschlossen war. Die vier Gerätetypen unterschieden sich lediglich durch ihre magensaftresistente Beschichtung, die sich bei pH 5,5 (Typ 1), pH 6 (Typ 2) und pH 7,5 (Typ 3 und 4) auflöste (Abb. 1a). Die Dicke und pH-Reaktionsfähigkeit der Beschichtung ermöglichte die Probenahme an bestimmten Stellen des Darmtrakts nach der Magenentleerung. Die Geräte enthielten außer einem passiven Radiofrequenz-Identifikationschip zur Ortung keine Elektronik. Sobald sich die Beschichtungen aufgelöst hatten, dehnte sich eine elastische Sammelblase aus und sammelte durch Vakuumsaugung bis zu 400 µl Lumeninhalt. Das Einwegventil verhinderte Probenverlust und Kontamination durch nachgeschaltete Flüssigkeiten. Stuhlproben wurden bei –20 °C eingefroren und alle Geräte wurden vor der Analyse aus dem Stuhl entnommen. Der flüssige Inhalt wurde mithilfe von Injektionsnadeln aus den Geräten entnommen. Aliquots der Rohprobe wurden für 16S-ribosomale RNA-Mikrobiomanalysen verwendet und die Überstände zentrifugierter Proben wurden für metabolomische Studien verwendet. Hier führen wir eine sorgfältige Analyse des Metaboloms in denselben Proben durch und berichten über Metaboliten, die noch nie zuvor in menschlichen Proben nachgewiesen wurden, wichtige Biomarker der Ernährung und den Vergleich chemischer Profile zwischen und innerhalb der Teilnehmer (Ergänzungstabellen 1 und 2).

a, Studiendesign für die Untersuchung des oberen Darmtrakts. Vier Arten von Darmprobenentnahmegeräten wurden verwendet, um Proben vom proximalen bis zum distalen oberen Darm zu entnehmen. Fünfzehn menschliche Teilnehmer schluckten nach einem ersten Test am ersten Tag innerhalb von zwei Tagen nach dem Mittagessen und nach dem Abendessen mindestens 16 Geräte. Die Geräte wurden entnommen und mit gezielten und nicht gezielten LC-MS/MS- und GC-MS-Methoden analysiert. b, Identifizierte Metaboliten aus den fünf Metabolom-Assays, die zur Analyse von Proben verwendet wurden. Die Einbeziehung chemischer Klassenfraktionen basiert auf der automatisierten ClassyFire-Chemikalienklassifizierung. c: Die Signifikanz der Unterschiede zwischen den Regionen des oberen Darmtrakts wurde mithilfe von LMM berechnet. Die horizontale gestrichelte Linie stellt die Signifikanzschwelle P < 0,05 dar (n = 1.182 Metaboliten). Kreise zeigen Nicht-Signifikanz an und Rautenformen zeigen Signifikanz (P < 0,05) nach FDR-Korrektur an. In diese Analyse wurden nur Metaboliten einbezogen, die in >50 % der Darmproben nachgewiesen wurden (n = 1.182). Der Effektgrößenkoeffizient ist die durch LMM geschätzte Steigung, wobei ein positiver (negativer) Koeffizient höhere (niedrigere) Werte im distalen im Vergleich zum proximalen oberen Darm anzeigt. Vertikale strichpunktierte Linien entsprechen einem Effektgrößenkoeffizienten von ±0,2.

Der gemessene pH-Wert des Lumeninhalts für die Gerätetypen 1 bis 4 stimmte mit dem erwarteten pH-Gradienten im gesamten Darmtrakt4,5 überein und deckte den Zwölffingerdarm, das Jejunum, das Ileum und den aufsteigenden Dickdarm ab (Abb. 1a). Der pH-Wert in Geräten vom Typ 1 und 2 unterschied sich signifikant von Geräten vom Typ 3 und 4 (Extended Data Abb. 1a und Ergänzungstabelle 3; Wilcoxon-Zwei-Wege-Rangsummentest, P = 2,4 × 10–14), der pH-Wert dagegen nicht signifikante Unterschiede zwischen Typ-1- und Typ-2-Geräten oder zwischen Typ-3- und Typ-4-Geräten (Extended Data Abb. 1a). Wir assoziierten daher Geräte vom Typ 1/2 und 3/4 mit proximalen (Duodenum und Jejunum) bzw. distalen (Ileum und aufsteigendem Dickdarm) Regionen des oberen Darmtrakts.

Wir verwendeten fünf Massenspektrometrietests, um den von diesen Kapselgeräten erfassten Lumeninhalt und die zugehörigen Stuhlproben zu analysieren. Durch den Abgleich chromatographischer Retentionszeiten, genauer Vorläufermassen und massenspektrometrischer Fragmentierung (MS/MS) mit öffentlichen und NIST20-lizenzierten Bibliotheken von MassBank.us haben wir 1.909 Chemikalien aus Darmluminal- und Stuhlinhalten mit den Konfidenzniveaus 1–3 der Metabolomics Standards Initiative annotiert (Ergänzungstabelle). 1)6, einschließlich 155 interner Standards, die zur Qualitätskontrolle (QC) und Quantifizierungszwecke verwendet werden. Darüber hinaus wurden > 12.000 unbekannte chromatographische Merkmale zuverlässig über dem Niveau der Methodenblindwerte erkannt (Ergänzungstabelle 2). Mithilfe der ClassyFire-Software7 wurden strukturell kommentierte Metaboliten in 61 chemische Unterklassen eingeteilt (Ergänzungstabelle 1). Zwei ungezielte hochauflösende Flüssigchromatographie (LC)-MS/MS-Assays mit Schwerpunkt auf hydrophilen und lipophilen Metaboliten ergaben mit 1.612 Identifizierungen die meisten annotierten Verbindungen. Durch ungezielte Gaschromatographie (GC)-MS wurden 119 Primärmetaboliten hinzugefügt, ergänzt durch die gezielte Bestimmung von sechs kurzkettigen Fettsäuren (SCFAs) und einen gezielten LC-MS/MS-Assay für 17 Gallensäuren (Abb. 1b). Die QC-Analyse der gesamten Stoffwechselvarianz ergab eine Trennung von Stuhl- und Darmproben mit einer starken Häufung gepoolter Qualitätskontrollproben (Erweiterte Daten, Abb. 1b).

Die Metabolomergebnisse zeigten bemerkenswerte Unterschiede zwischen Stuhl- und Darmproben (Erweiterte Daten, Abb. 2) und zwischen den Darmtraktproben (Erweiterte Daten, Abb. 3). Um räumliche Unterschiede im Darm aufzudecken, verwendeten wir lineare Mixed-Effect-Modelle (LMMs), die den Ort der Probenahme (proximal oder distal) sowie andere Variablen berücksichtigten (Ergänzungstabellen 3 und 4). Konkret untersuchten wir die 1.182 häufigsten Metaboliten, die in >50 % der Geräteproben nachgewiesen wurden. Davon unterschieden sich 630 (54 %) im proximalen im Vergleich zum distalen Oberdarm signifikant (False Discovery Rate (FDR) P < 0,05; LMM) (Abb. 1c und Ergänzungstabelle 4), wobei 473 Metaboliten in höheren Konzentrationen vorlagen proximal im Vergleich zum distalen oberen Darm und 157 Verbindungen auf niedrigeren Ebenen im proximalen im Vergleich zum distalen oberen Darm (Abb. 1c). Bekannte mikrobiell erzeugte Chemikalien, darunter SCFAs8,9, sekundäre Gallensäuren10 und einige mikrobiell konjugierte Gallensäuren11,12, nahmen vom proximalen zum distalen oberen Darm zu (erweiterte Datentabelle 1 und Abb. 1c). Von den 11 nachgewiesenen acetylierten Aminosäuren stiegen 7 vom proximalen zum distalen oberen Darm (Roh-P < 0,05; LMM) (erweiterte Datentabelle 1 und Abb. 1c). Wir untersuchten auch die 12.346 chemisch nicht annotierten Metabolitensignale und beschränkten unsere Aufmerksamkeit auf 9.317 Signale, die in> 50% der Darmproben nachgewiesen wurden (Ergänzungsdatei 1). Insgesamt unterschieden sich 3.594 (38 %) Merkmale signifikant zwischen dem proximalen und dem distalen oberen Darm, wobei 1.937 Merkmale auf höheren Ebenen im proximalen im Vergleich zum distalen oberen Darm und 1.657 Merkmale auf niedrigeren Ebenen im proximalen im Vergleich zum distalen oberen Darm lagen (FDR P < 0,05; LMM) (Erweiterte Daten Abb. 4).

Um allgemeine Stoffwechselunterschiede zwischen Standorten abzufragen, verwendeten wir Statistiken zur chemischen Anreicherung. Di- und Tripeptide gehörten zu den am stärksten verminderten Klassen vom proximalen bis zum distalen oberen Darm (Extended Data Table 1 und Extended Data Abb. 5). Von den 333 gemessenen Di- und Tripeptiden nahm die Häufigkeit von 262 vom proximalen zum distalen oberen Darm signifikant ab (Rohwert P < 0,05; LMM) (Erweiterte Datentabelle 1). Auch Zucker, Zuckeralkohole, Nukleoside, Carnitine und Ceramide wiesen in Proben aus dem proximalen Darmtrakt signifikant höhere Konzentrationen auf als in Proben aus dem distalen Darm (Extended Data Table 1 und Extended Data Abb. 5). Diese räumlichen Unterschiede im Darm spiegeln die klassische Verdauung und Absorption13 von Di- und Tripeptiden14 und Acylcarnitinen15,16 sowie Ceramiden wider, die vor der Darmaufnahme zu Sphingosin und freien Fettsäuren hydrolysiert werden17. Im Gegensatz dazu wiesen SCFAs erhöhte Werte in distalen Regionen auf (erweiterte Datentabelle 1 und Abb. 1c), was wahrscheinlich auf ihre Produktion durch Mikroben zurückzuführen ist8,9. Acetylierte Aminosäuren, die mit Morbus Crohn in Verbindung gebracht werden18, lagen im distalen oberen Darm ebenfalls in höheren Konzentrationen vor als im proximalen oberen Darm (Erweiterte Datentabelle 1 und Abb. 1c), möglicherweise aufgrund der langsameren Absorption acetylierter im Vergleich zu nicht acetylierter Aminosäuren19 ,20. Gallensäuren werden von Mikroben umfassend umgewandelt und die Konzentration sekundärer Gallensäuren im Darm erhöht4. Diese Beobachtungen stützen die Annahme, dass die Kapselgeräte Proben an den vorgesehenen Orten entnommen haben. Obwohl die durchschnittlichen pH-Werte über Geräte eines bestimmten Typs auch im oberen Darmtrakt den erwarteten Trends folgten, korrelierte die beobachtete pH-Schwankung innerhalb einer Person für jeden Gerätetyp nicht mit metabolischen Veränderungen zwischen distalen und proximalen Regionen.

Wir haben 28 phenolische Metaboliten gemessen, die vom proximalen zum distalen oberen Darm zunahmen (Ergänzungstabelle 4). Diese Trends werden wahrscheinlich durch eine Kombination von Faktoren verursacht, einschließlich enzymatischer Transformation21,22 wie Deglykosylierung und verzögertem Abbau von Pflanzenzellen und Zellwandkomponenten durch mikrobielle Enzyme23,24,25. Beispielsweise war das mit Leinsamen verbundene Lignan Secoisolariciresinol in distalen Proben im Vergleich zu proximalen Proben am signifikantesten angereichert, was wahrscheinlich sowohl auf die Bioverfügbarkeit26 als auch auf die Deglykosylierung27 zurückzuführen ist.

Auch die Konzentration von Dicarbonsäuren nahm vom proximalen zum distalen oberen Darm zu (Erweiterte Datentabelle 1 und Abb. 1c). Tatsächlich waren drei der sechs am stärksten erhöhten Metaboliten zwischen dem proximalen und distalen oberen Darm Dicarbonsäuren (Hexadecandisäure, Tetradecandisäure und Octadecandisäure) (Abb. 1c). Dicarbonsäuren entstehen beim Abbau (Omega-Oxidation) von Fettsäuren, der in menschlichen Zellen28, Pflanzen29 und Mikroben30,31 stattfindet. Die Leitverbindung Hexadecandisäure korrelierte am stärksten mit anderen Dicarbonsäuren, Pflanzenmetaboliten, Gallensäuren und bekannten mikrobiell hergestellten Verbindungen (Ergänzungstabelle 5). Epithelzellen enthalten omega-hydroxylierte Lipide, die für die Aufrechterhaltung der Barrierefunktion des Epithels unerlässlich sind32 und die durch Lipasen gespalten werden können, um Dicarbonsäuren zu bilden. Wir gehen davon aus, dass der konsistente und signifikante Anstieg der Dicarbonsäuren entlang des oberen Darms auf den Abbau menschlicher Epithellipide zurückzuführen ist.

Die chemischen Profile der Darmproben unterschieden sich erheblich von denen des Stuhls (Extended Data Abb. 2). Einunddreißig Metaboliten kamen im Darm im Durchschnitt mehr als 100-mal häufiger vor als im Stuhl. Diese Metaboliten bestanden aus glycinierten Lipiden, Zuckern, pflanzlichen Naturprodukten, Carnitinen, mikrobiell konjugierten Gallensäuren und S-Succinylcystein (Ergänzungstabelle 6). Peptide waren in Stuhlproben im Allgemeinen auch in viel geringeren Konzentrationen vorhanden als in Darmproben, insbesondere im Vergleich zum proximalen Darm (Erweiterte Daten, Abb. 2). Wir identifizierten außerdem mehr als 100 Metaboliten, die im Stuhl mehr als 100-mal häufiger vorkamen als in Darmproben (Ergänzungstabelle 6); Bei diesen Metaboliten handelte es sich hauptsächlich um polare Lipide wie Phosphatidylethanolamine, Phosphatidylinositole und Phosphatidylglycerine sowie spezifische FAHFAs. Die hohe Häufigkeit von Membranlipiden in Stuhlproben ist wahrscheinlich auf die große Menge an bakteriellem Zellmaterial im Stuhl im Vergleich zu Lumenproben aus dem oberen Darm zurückzuführen.

Als nächstes verwendeten wir LMM, um Zusammenhänge zwischen den von den Teilnehmern aufgezeichneten Nahrungsaufnahmeprotokollen und den Spiegeln von Metaboliten im Darmtrakt zu testen. Wir haben den Verzehr von Obst, Alkohol, Desserts, tierischem Eiweiß, Gemüse, Getreide, Kaffee/Tee und Milchprodukten getestet, die 6 Stunden vor dem Schlucken von Kapselgeräten eingenommen wurden (Ergänzungstabelle 3). Nach der Korrektur für Tests mit mehreren Hypothesen wiesen einige Lebensmittelarten keine signifikant assoziierten Metaboliten auf, was aufgrund der geringen Stichprobengröße für einige Lebensmittelarten und der starken FDR-Korrektur, die Tests von 1.182 Metaboliten ausmachte, nicht überraschend war (Tabelle 1, Abb. 2a–d und Ergänzungstabelle). 4). Trotz der geringen Größe dieser Studie mit 15 Teilnehmern konnten wir eine Reihe von Ernährungsbiomarkern validieren, die zuvor im Blut gefunden wurden und mit dem Konsum von Obst33 und Alkohol34 korrelierten, sowie andere Biomarker entdecken, die zuvor nicht identifiziert wurden.

a,b,d, Vulkandiagramme zeigen die Bedeutung jedes Metaboliten für die von LMM berechneten Lebensmittelarten Obst (a), Alkohol (b) und Dessert (d). Der Verzehr ist definiert als Nahrung, die innerhalb von 6 Stunden nach dem Verschlucken der Probengeräte verzehrt wird. Die Signifikanz von P < 0,05 (n = 1.182 Metaboliten) wird durch die untere strichpunktierte horizontale Linie begrenzt. Kreise zeigen Nicht-Signifikanz nach FDR-Korrektur an und Rauten zeigen Signifikanz (P < 0,05) nach FDR-Korrektur an (n = 1.182). In diese Analyse wurden Metaboliten einbezogen, die in >50 % der Darmproben nachgewiesen wurden. Der Effektgrößenkoeffizient ist die von LMM berechnete Steigungsschätzung, wobei ein positiver (negativer) Koeffizient bedeutet, dass der Metabolit nach der Nahrungsaufnahme höher (niedriger) war. Vertikale strichpunktierte Linien entsprechen einem Effektgrößenkoeffizienten von ±0,2. c: Die Analyse der chemischen Anreicherungsstatistik (ChemRICH) ergab signifikante chemische Klassen nach dem Verzehr von Früchten, visualisiert durch die Trennung der Klassen nach chemischer Lipophilie (logP) und dem Signifikanzniveau der chemischen Klasse von −log10(P). Rote Kreise zeigen an, dass die chemische Klasse nach dem Verzehr von Obst zunahm, und blaue Kreise zeigen an, dass die chemische Klasse nach dem Verzehr von Obst abnahm. Die Kreisgröße gibt die Größe der chemischen Klasse an. e, Theophyllin- und Theobrominspiegel hängen stark mit dem Koffeinspiegel zusammen. Kreise stellen die gemessenen Werte in jeder Probe dar, für die beide Metaboliten nachgewiesen wurden. f, Chemisches Diagramm von Koffein und bekannten Stoffwechselwegen mit Strukturen der nachgewiesenen Metaboliten und Spearman-Rangkorrelationskoeffizienten (rs) für jede Struktur (P < 1,0 × 10−13 für alle Metaboliten; n = 1.182 Metaboliten).

Unter Verwendung von Effektgrößenunterschieden von ± 0,2 und einem Roh-P < 0,05 war der Obstverzehr signifikant mit 20 Verbindungen bei erhöhter Konzentration und 17 Metaboliten bei verringerter Konzentration verbunden (Abb. 2a). Einige Metaboliten standen selbst bei strengem FDR-korrigiertem P < 0,05 in direktem Zusammenhang mit dem Obstkonsum (Abb. 2a), darunter N-Methylprolin und Stachydrin, die beide zuvor in nicht kontrollierten Ernährungsstudien als Obstkonsum-Biomarker für Blutplasma gemeldet wurden33. Betonicin, ein bekannter Bestandteil von Fruchtsäften35, stieg nach dem Verzehr von Früchten bei einem rohen P < 0,05 ebenfalls an (Abb. 2a), erreichte jedoch nicht die FDR-Signifikanzschwelle. In ähnlicher Weise stiegen auch drei Ketosäuren (4-Methyl-2-Oxovaleriansäure, Ketoisovaleriansäure und 3-Methyl-2-Oxovaleriansäure) als Reaktion auf den Obstverzehr bei Roh-P < 0,05 signifikant an (Abb. 2a). Metaboliten sind nicht unabhängig voneinander, sondern über Nahrungszusammensetzungen sowie mikrobielle und enzymatische Wege miteinander verbunden. Daher verwendeten wir die ChemRICH-Anreicherungsstatistik für chemische Mengen, um signifikant veränderte Metabolitencluster zu identifizieren (Abb. 2c). Diese Strategie ergab, dass Ketosäuren die chemische Klasse mit der stärksten Reaktion auf Früchte sind (Abb. 2a, c), was Ketosäuren als Obst-Biomarker im menschlichen Darm hervorhebt. Ketosäuren werden durch enzymatische Desaminierung von Aminosäuren gebildet, die teilweise durch Darmbakterien durchgeführt wird36. Bemerkenswert ist, dass ChemRICH auch zeigte, dass typische Fruchtinhaltsstoffe wie Phenylacetate und phenolische Naturstoffe positiv mit dem Obstverzehr verbunden sind (Abb. 2c).

Alkoholkonsum war am signifikantesten mit Ethylsulfat (FDR P < 0,05) verbunden, einem bekannten Plasma-Biomarker für Alkoholkonsum (Abb. 2b)34. Stachhydrin war sowohl mit Obst- als auch mit Alkoholkonsum verbunden (FDR P < 0,05). Trp-Lys nahm mit dem Alkoholkonsum nach der FDR-Korrektur signifikant ab (Abb. 2b). Insgesamt nahmen 40 Di- und Tripeptide mit dem Alkoholkonsum ab (Roh-P < 0,05) mit einem ChemRICH-Cluster P = 8,8 × 10−18 (Ergänzungstabelle 4 und ergänzende Abbildungen 1 und 2). Die Abnahme der Di- und Tripeptide nach Alkoholkonsum deutete auf eine Abnahme der Gesamtproteaseaktivität hin, die möglicherweise eher auf eine beeinträchtigte Pankreassekretion37,38 als auf eine direkte Hemmung zurückzuführen ist, da Trypsin und Chymotrypsin sogar in 20 %iger Ethanollösung aktiv sind39. „Dessert“ wurde als Verzehr von fett- und zuckerreichen Lebensmitteln wie Limonade, Kuchen und Eiscreme definiert. Zwei substituierte Benzoesäuren, 3-Hydroxy-4-methoxybenzoesäure und 3,4-Dihydroxybenzoesäure, wurden mit Dessert in Verbindung gebracht (Roh-P <0,05) (Abb. 2d). Diese Verbindungen sind Stoffwechselzwischenprodukte beim Abbau von Vanillin und Isovanillin40. Neochlorogensäure war auch signifikant mit Dessert assoziiert (Rohwert P < 0,05). Neochlorogensäure ist in einer Vielzahl von Früchten und Beeren41 enthalten, darunter Kirschen42 und Pfirsiche43. Andere Lebensmittelarten, die in das Mixed-Effect-Modell einbezogen wurden, wiesen ebenfalls signifikant assoziierte Metaboliten auf (Ergänzungstabelle 4 und ergänzende Abbildungen 1 und 2).

In den meisten Proben wurde Koffein nachgewiesen (Ergänzungstabelle 1). Bemerkenswert ist, dass Koffein während des Versuchszeitraums nicht signifikant mit dem Kaffee- oder Teekonsum assoziiert war (FDR P = 0,87) (Ergänzungstabelle 4), was höchstwahrscheinlich darauf zurückzuführen ist, dass Koffein innerhalb von 1 Stunde nach oraler Einnahme schnell absorbiert wird und eine mittlere Halbwertszeit von hat 4,5 h (Bereich 2,7–9,9 h) im Blutkreislauf44; Die Stoffwechselwege von Koffein konnten jedoch durch die Spearman-Rangkorrelationsanalyse leicht erkannt werden. Die sechs Metaboliten, die bei FDR P < 10–13 am stärksten mit Koffein korrelierten, waren bekannte Koffeinkataboliten 45, 46, 47, einschließlich Theophyllin und Theobromin (Abb. 2e, f). Koffein wird auf verschiedenen Wegen verstoffwechselt und ausgeschieden, unter anderem über den Urin48 und die Galle49. Galle ist der erwartete Ursprung des in dieser Studie gemessenen Koffeins, da zwischen dem Getränkekonsum und der Probennahme durch das Gerät mehrere Stunden vergingen. Obwohl bekannt ist, dass Theobromin in Schokolade enthalten ist, wurde es nicht mit dem Verzehr von Desserts, sondern nur mit dem Koffeinstoffwechsel in Verbindung gebracht. Daher können Metabolitenkorrelationen im oberen Darmtrakt die Rekonstruktion mikrobieller und enzymatischer Wege des Exposomenstoffwechsels ermöglichen. Um spezifische Lebensmittelbiomarker zuzuordnen, wären spezielle Studien in einer vielfältigen Bevölkerung erforderlich, bei denen Ernährungsinterventionen zum Einsatz kommen. Da die Geräte außerdem die Lebensfähigkeit der Bakterien weitgehend bewahren4, könnten aus den Geräten gewonnene kultivierte Isolate verwendet werden, um individuelle Wechselwirkungen zwischen Nahrungsmittelmetabolom und Bakterien zu bestätigen.

Nahrungsmetaboliten waren mit zeitlichen Unterschieden während der zweitägigen und vier Probenahmezeitpunkte dieser Studie verbunden. Um zu untersuchen, ob die Probenahmezeit oder die Probenahmeregion einen größeren Einfluss auf die Metaboliten im oberen Darm hatten, verwendeten wir eine Varianzanalyse (ANOVA), um die Anzahl der Metaboliten zu berechnen, die sich zwischen den vier Gerätetypen pro Teilnehmer oder zwischen den vier Probenahmezeitpunkten signifikant unterschieden ( nach jeder Mahlzeit) durch den Teilnehmer. Die großen Unterschiede in den Metabolitenspiegeln zwischen den proximalen und distalen Probenregionen wurden oft durch metabolische Unterschiede zwischen den Zeitpunkten ersetzt, was zeigt, dass 12 von 15 Teilnehmern statistisch gesehen mehr unterschiedliche Metaboliten zwischen den Mahlzeiten (Zeitpunkten) als zwischen den Darmregionen (Gerätetypen) aufwiesen (Erweitert). Daten Abb. 6a,b). Eine genauere Untersuchung der Verbindungsklassen, die zu diesen Unterschieden beitrugen, ergab, dass Di- und Tripeptide (innerhalb der chemischen Klasse der Carbonsäuren) die größte chemische Klasse waren, die zwischen Gerätetypen unterschied, und bei fünf Teilnehmern >70 % aller deutlich unterschiedlichen Metaboliten darstellten und >40 % für weitere sieben Teilnehmer (Extended Data Abb. 7a). Für Metaboliten, die die Probenahmezeitpunkte differenzierten, waren Zucker (organische Sauerstoffverbindungen) bei 13 von 15 Teilnehmern angereichert (Erweiterte Daten, Abb. 7b). In ähnlicher Weise wurde festgestellt, dass Imidazopyrimidine, Indole und Isoflavonoide signifikanter unterschiedliche Probenahmezeitpunkte als Darmregionen unterscheiden (Erweiterte Daten, Abb. 7). Diese Klassen bezeichnen Nahrungsmetaboliten, die sich aufgrund der Variation zwischen den während verschiedener Mahlzeiten aufgenommenen Nahrungsmittelarten unterschieden, aber für die Unterscheidung zwischen Darmregionen nicht so nützlich waren.

Unser Datensatz wies große interindividuelle Unterschiede auf (Erweiterte Daten, Abb. 7). Da den Teilnehmern keine bestimmten Mahlzeiten verschrieben wurden, sollte eine ernährungsbedingte Variation die Teilnehmer und Zeitpunkte unterscheiden. Mithilfe einer multivariaten Diskriminanzanalyse (PLS-DA) identifizierten wir Unterschiede im Anteil der Metaboliten, die für die Unterscheidung zwischen proximalem und distalem Darm (Gerätetypen) am wichtigsten waren, und zwischen den 15 Teilnehmern (Extended Data Abb. 6b). Die große Gesamtvarianz zwischen den Proben verdeckte eine klare Visualisierung von PLS-DA basierend auf Teilnehmern, Geräten oder Zeitpunkten. Dennoch zeigten die 100 Metaboliten, die am meisten zur multivariaten Diskriminierung beitrugen, teilnehmerspezifische Trends, die am besten durch Metaboliten pflanzlichen und mikrobiellen Ursprungs erklärt werden konnten (Extended Data Abb. 6b), darunter die Pfefferverbindung Capsaicin, die Leinsamenverbindung Secoisolariciresinol und die mikrobiell hergestellte Buttersäure Säure und Propionsäure (Ergänzungstabelle 7). Andere Metaboliten, die teilnehmerspezifische Unterschiede aufwiesen, wie N-Methylhistamin, Phenethylamin, Phenylacetaldehyd und Bernsteinsäure, können von einer Kombination menschlicher, ernährungsbedingter oder mikrobieller Faktoren abhängen. Bemerkenswerterweise trennte die hierarchische Gruppierung die Stuhlproben nach Teilnehmern, wohingegen Darmproben nicht stark nach Teilnehmern gruppierten (ergänzende Abbildung 3), was möglicherweise auf die höhere Häufigkeit individuell spezifischer Darmmikroben im Stuhl im Vergleich zum proximalen Darm zurückzuführen ist, der größer war dominiert durch die Variabilität der Nahrungsbestandteile.

Obwohl eine große Gesamtvariation die direkte Visualisierung interindividueller Unterschiede bei der Verwendung aller Daten in PLS-DA-Projektionen verdeckte, zeigten bestimmte Verbindungen sehr große Konzentrationsunterschiede zwischen Individuen (Abb. 3). Beispielsweise variierten die aus menschlichem Häm gewonnenen Gallenpigmente Biliverdin und Bilirubin sowie die mikrobiell produzierten Urobilin und Stercobilin bei einigen Teilnehmern drastisch zwischen den Geräten und waren bei bestimmten Teilnehmern ebenfalls stark reduziert oder fehlten, wie beispielsweise Stercobilin bei den Teilnehmern 10 und 15 (Abb. 3). ). Es wurde vorgeschlagen, dass die Produktion sekundärer Gallensäuren einen ähnlichen enzymatischen Weg wie die Stercobilin-Produktion nutzt50,51 und die beiden Teilnehmer mit niedrigen Stercobilin-Spiegeln zeigten auch eine verringerte Konzentration von Desoxycholsäure, einer sekundären Gallensäure (Abb. 3). Die gleichen teilnehmerspezifischen Profile von Gallenfarbstoffen wurden auch in Stuhlproben beobachtet (Extended Data Abb. 8). Bemerkenswert ist, dass diese beiden Teilnehmer (10 und 15) die einzigen waren, die in den sechs Monaten vor der Studie über den Einsatz von Antibiotika berichteten. Diese Personen zeichneten sich durch sehr niedrige Werte an Stercobilin, Desoxycholsäure, einer Untergruppe von FAHFAs und Sulfonlipiden aus (Abb. 3), die alle zuvor mit der Darmmikrobiota in Verbindung gebracht wurden10,51,52,53. Orale Antibiotika können die Darmmikrobiota noch mehr als ein Jahr nach der Behandlung beeinträchtigen54. Diese Daten stützen die Hypothese, dass Stoffwechselprofile Unterschiede in der mikrobiellen Aktivität für bestimmte Stoffwechselwege widerspiegeln. Aufgrund der begrenzten statistischen Aussagekraft konnten wir aufgrund der begrenzten statistischen Aussagekraft keine signifikanten Zusammenhänge zwischen der Häufigkeit mikrobieller Arten anhand der Quantifizierung des 16S-rRNA-Gens und den Stercobilin-Spiegeln feststellen. Das Vorhandensein von FAHFAs und Sulfonlipiden war jedoch mit der unterschiedlichen Häufigkeit spezifischer mikrobieller Arten verbunden.

Zu den Metaboliten gehören Gallenfarbstoffe, Fettsäureester von Hydroxyfettsäuren (FAHFAs und AAHFAs), SCFAs, Sulfonlipide (SLs) und sekundäre Gallensäuren. Die Proben werden von den Teilnehmern organisiert und der Antibiotikaverbrauch ist für die beiden Teilnehmer angezeigt, die 1 und 5 Monate vor dieser Studie Antibiotika eingenommen haben. Die Farbe der Wärmekarte reicht von niedrig (blau) bis hoch (rot) der Metabolitenhäufigkeit (Peakhöhe) oder Konzentration (in Nanogramm pro Milliliter) für Gallensäuren. Minimal- und Maximalwerte werden verwendet, um die Farbskala für jeden Metaboliten (jede Zeile) festzulegen.

FAHFAs wurden erstmals vor 10 Jahren identifiziert. Sie sind biologisch aktiv und regulieren die Physiologie55,56. Acyl-α-hydroxyl-Fettsäuren (AAHFAs) sind eine spezifische Untergruppe von FAHFAs mit einer α-Lipid-Bindung, die erst vor zwei Jahren entdeckt wurden53. Wir haben in dieser Studie 88 FAHFAs identifiziert (Ergänzungstabelle 1). Bemerkenswerterweise zeigten vier spezifische FAHFAs sehr konsistente Unterschiede zwischen den Teilnehmern und alle diese FAHFAs sind Verknüpfungen eines langkettigen Hydroxylfettsäure-Rückgrats, das mit kurzkettigen C3- oder C4-Einheiten verestert ist. Drei dieser bioaktiven Lipide sind an der α-Position verestert (AAHFA 4:0/22:0, AAHFA 3:0/22:0 und AAHFA 3:0/24:0) und eines ist an anderer Stelle des Rückgrats verestert (FAHFA). 3:0/23:0). Neun Teilnehmer wiesen häufig hohe Mengen dieser FAHFAs auf, während sechs Teilnehmer nur sehr geringe oder nicht nachweisbare Mengen produzierten (Abb. 3). Da nicht nachweisbare Werte für die ANOVA-Statistik nicht verwendet werden können, haben wir keinen Signifikanztest durchgeführt. Die gleichen personenspezifischen Trends wurden in Stuhlproben beobachtet (Extended Data Abb. 8). Der einzige andere häufig nachgewiesene FAHFA mit einer C3- oder C4-Seitenkette und einer langkettigen Fettsäure war AAHFA 16:0/4:0, der nicht dem gleichen individuellen Trend folgte wie die vier oben diskutierten FAHFAs. Bemerkenswert ist, dass geringe Mengen an langkettigen Fettsäuren oder SCFA-Substraten, Propionsäure (C3:0) und Buttersäure (C4:0), die beobachteten Unterschiede dieser kurzkettigen FAHFAs in Darm- oder Stuhlproben nicht erklären konnten (Abb. 3 und erweiterte Daten Abb. 9). Wir haben daher untersucht, ob bestimmte Bakterien mit der Anwesenheit oder Abwesenheit der vier interessierenden FAHFAs verbunden sind. Zwei Taxa, eine Art der Gattung Blautia, die phylogenetisch am engsten mit Blautia obeum verwandt ist, und Proteobakterien, die mit Bilophila wadsworthia verwandt sind, waren signifikant mit dem Nachweis dieser FAHFAs verbunden (Ergänzungstabelle 8). B. obeum ist ein bekannter SCFA-Produzent57, was darauf hindeutet, dass die Produktion der kurzkettigen Fettacylbestandteile ein Treiber für die individuelle FAHFA-Produktion sein könnte; FAHFA 4:0/16:0 zeigte jedoch nicht den gleichen individuenspezifischen Trend, was darauf hindeutet, dass die Blautia-Arten spezifisch FAHFAs mit Propion- und Buttersäureestern von hydroxylierten, sehr langkettigen Fettacylsäuren (22:0 und 23) produzieren könnten :0) und nicht aus Hydroxylformen der am häufigsten vorkommenden Fettsäuren, C16–18. Es wurde gezeigt, dass eine chemisch verwandte Gruppe von FAHFAs die Glukosehomöostase verbessert, die Insulinsensitivität stimuliert und entzündungshemmende Wirkungen hat55. Somit haben unsere Ergebnisse potenzielle Auswirkungen auf die Gesundheit und stellen außerdem einen Zusammenhang zwischen der Darmchemie und den FAHFA-Spiegeln beim Menschen her.

Hier berichten wir über den Nachweis von Sulfonlipiden in menschlichen Proben. Diese Lipide wurden erst kürzlich zu Lipidombibliotheken hinzugefügt58, was zu der Entdeckung führte, dass sie im Darmtrakt von Mäusen mikrobiell produziert werden und sowohl mit pro- als auch antiinflammatorischen Phänotypen verknüpft sind59,60,61. In Proben von Darmgeräten konnten wir Sulfonlipide mit starken interindividuellen Trends unabhängig vom Zeitpunkt der Probenahme (Mahlzeiten) nachweisen, was darauf hindeutet, dass Sulfonlipide bei einigen Personen mikrobiell produziert wurden, bei anderen jedoch nicht. Die beiden Teilnehmer, die zuvor Antibiotika erhalten hatten, wiesen deutlich niedrigere Sulfonlipidwerte auf als alle anderen Personen (Abb. 3), was darauf hindeutet, dass die Antibiotika-Behandlung möglicherweise die mikrobiellen Produzenten eliminiert hat. Bemerkenswerterweise fehlten Sulfonlipide auch in bestimmten Proben anderer Teilnehmer, was uns dazu veranlasste, Zusammenhänge von Sulfonlipiden mit bakteriellen Taxa zu untersuchen. Zehn Taxa waren in sulfonolipidhaltigen Proben signifikant angereichert, darunter ein Mitglied der Familie Desulfovibrionaceae (Ergänzungstabelle 8), eine Familie, die mit Colitis ulcerosa in Verbindung gebracht wird62. Ebenfalls angereichert wurden zwei Mitglieder von Bacteroidetes, einem Stamm mit bekannten Sulfonlipidproduzenten60. Die gesundheitlichen Auswirkungen des Sulfonlipidspiegels beim Menschen sind nicht genau bekannt. Kürzlich wurde gezeigt, dass Sulfonolipide die Entzündungsreaktionen in Makrophagen verstärken, in Gegenwart von Lipopolysacchariden jedoch die Entzündung verringern63. Weitere Untersuchungen sind erforderlich, um den Zusammenhang von Sulfonlipiden mit der menschlichen Gesundheit zu bestimmen.

Diese Arbeit liefert einen Bericht über Metabolomunterschiede im oberen Darmtrakt bei gesunden menschlichen Teilnehmern, die ein nicht-invasives, einnehmbares Probenahmegerät verwenden. Unsere Ergebnisse öffnen die Tür für zukünftige detaillierte In-vivo-Studien zu Verdauungs- und Darmerkrankungen. Wie erwartet unterschied sich das Metabolom des Stuhls stark von dem des Darms. Somit kann der Stuhl nicht als Ersatz für den Darmtrakt dienen, sondern (bestenfalls) nur für den Dickdarminhalt. Sogar innerhalb des Darmtrakts wiesen >50 % der annotierten Metaboliten signifikant unterschiedliche Konzentrationen zwischen proximalen und distalen Stellen auf. Ein wichtiges Ziel zukünftiger Untersuchungen besteht darin, die Wirkung von Antibiotika auf intestinale Sulfonlipid-, Stercobilin- und langkettige AAHFA-produzierende Bakterien sowie die Folgen solcher Störungen für Gesundheit und Krankheit zu charakterisieren. Die Zerstörung dieser Bakterien durch Antibiotika kann mit der Häufigkeit und Ätiologie von Entzündungen, Diabetes und entzündlichen Darmerkrankungen zusammenhängen55,60,63. Daher wird es wichtig sein, die Dynamik und Mechanismen der Wiederbesiedlung dieser Mikroben bei mit Antibiotika behandelten Personen aufzudecken.

In unserer zugehörigen Begleitstudie4 verwendeten wir dieselben Geräteproben, um mithilfe verschiedener Omics-Ansätze die Variationen in der Darmumgebung umfassend zu untersuchen. Wie die in dieser Studie berichteten Ergebnisse zu Metabolomen fanden wir in Darmproben eine ausgeprägtere Prophageninduktion im Vergleich zu Stuhlproben und dass die Proteom- und Gallensäureprofile des Wirts entlang des Darms variierten und sich stark von denen des Stuhls unterschieden4. Ergänzend zu den hier berichteten großen Unterschieden bei Peptiden und Aminosäuren zwischen proximalen und distalen Darmstellen zeigen wir in unserer Begleitstudie, dass die Konzentrationen mikrobiell konjugierter Gallensäuren Aminosäure-abhängige Trends aufwiesen, die im Stuhl nicht erkennbar waren. Zusammengenommen veranschaulichen diese Studien den Nutzen der Probenentnahme direkt aus dem Darm, was unser Verständnis der engen Beziehung zwischen menschlichen Wirten und ihren kommensalen Mikroben verbessern sollte.

Als Pilotstudie weist unsere Studie mehrere Einschränkungen auf. Erstens wird eine größere Anzahl von Teilnehmern erforderlich sein, um Schlussfolgerungen über den Umfang des Darmstoffwechsels innerhalb und zwischen menschlichen Populationen zu ziehen, und größere Studien könnten auch detailliertere mikrobiomweite Zusammenhänge bestimmter Bakterien oder Bakterienfamilien mit Stoffwechselumwandlungen ermöglichen. Zweitens berichteten nur zwei Teilnehmer über den Einsatz von Antibiotika, daher muss der mögliche Zusammenhang zwischen dem Einsatz von Antibiotika und der Störung des Sulfonlipid- und FAHFA-Metabolismus in zukünftigen Studien verstärkt werden. Drittens war die Analyse der zeitlichen Variation auf zwei Zeitpunkte pro Tag an zwei aufeinanderfolgenden Tagen beschränkt, sodass Änderungen der metabolischen oder mikrobiellen Zusammensetzung im Laufe der Zeit nicht vollständig bewertet wurden. Viertens müssen die Zusammenhänge zwischen der Zusammensetzung der Mikrobiota im oberen Darm und der Variabilität bei Krankheitszuständen, wie z. B. dem Überwachsen von Dünndarmbakterien, spezifischer, getrennter Untersuchungen unterzogen werden. Trotz dieser Einschränkungen zeigen unsere Ergebnisse, dass der Einsatz nicht-invasiver Probenahmegeräte in Kombination mit Metabolomik und Genomik ein erhebliches Potenzial hat, präzisere Interventions- und Präventionsstrategien für die Behandlung von Ernährungsstudien und menschlichen Krankheiten zu ermöglichen.

In einer verwandten Begleitpublikation4 verwendeten wir denselben Text, um das Kapsel-Probenahmegerät (CapScan, Envivo Bio) zu beschreiben. Ein CapScan besteht aus einer hohlen elastischen Sammelblase, die mit einem Einwegventil4 verschlossen ist. Um das Gerät für die Verpackung vorzubereiten, wird die Sammelblase evakuiert, in der Mitte gefaltet und in einer auflösbaren Kapsel mit einem Durchmesser von 6,5 mm und einer Länge von 23 mm verpackt, auf die eine magensaftresistente Beschichtung aufgetragen wird. Die Kapsel und die magensaftresistente Beschichtung sollen eine Kontamination der Sammelblase durch Mund-, Rachen- und Magenmikroben während der Einnahme verhindern. Die magensaftresistente Beschichtung und die Kapsel zerfallen, wenn das Gerät den Ziel-pH-Wert erreicht, der bei Typ 1 bei pH 5,5, bei Typ 2 bei pH 6 und bei Typ 3 und Typ 4 bei pH 7,5 liegt, wobei Typ 4 auch über eine zeitverzögerte Beschichtung verfügt, um die Sammlung zu beeinflussen in Richtung des aufsteigenden Dickdarms. Nach dem Zerfall der magensaftresistenten Beschichtung entfaltet sich die Sammelblase und dehnt sich zu einem Schlauch mit 6 mm Durchmesser und 33 mm Länge aus, wodurch bis zu 400 µl Darminhalt durch das Einwegventil angesaugt werden. Die Integrität der in der Sammelblase gesammelten Probe wird durch das Einwegventil aufrechterhalten, während sich das Gerät durch den Dickdarm bewegt und dem Stuhl ausgesetzt wird.

In einer zugehörigen Begleitpublikation4 verwendeten wir denselben Text, um das Studiendesign zu beschreiben. Jeder Teilnehmer nahm gleichzeitig Sätze von vier Geräten mit jeweils unterschiedlichen Beschichtungen ein, um auf die proximalen bis medialen Bereiche des Dünndarms (Beschichtungstypen 1 und 2) und weiter distale Bereiche (Beschichtungstypen 3 und 4) abzuzielen. Nach der Probenahme wurden die Geräte im Stuhl in Probensammelbehälter gegeben und sofort eingefroren. Nach der Entnahme wurde der Stuhl aufgetaut und die Geräte wurden vom Studienpersonal entnommen. Zur Probenentnahme wurden die elastischen Sammelblasen in 70 %igem Isopropylalkohol gespült und mit einer sterilen Injektionsnadel, die an einer 1-ml-Spritze befestigt war, durchstochen. Die Proben wurden in Mikrozentrifugenröhrchen überführt und der pH-Wert mit einer InLab Ultra Micro ISM pH-Sonde (Mettler Toledo) gemessen. Für die Metabolomics-Analyse wurde ein 40-µl-Aliquot 3 Minuten lang bei 10.000 g zentrifugiert, um den Überstand zu sammeln. Der Rest der Probe wurde eingefroren, bis er zur DNA-Extraktion aufgetaut wurde.

In einer zugehörigen Begleitpublikation4 verwendeten wir denselben Text, um das Studiendesign zu beschreiben. Die Studie wurde vom WIRB-Copernicus Group Institutional Review Board (Studiennr. 1186513) genehmigt und von jedem Teilnehmer wurde eine Einverständniserklärung eingeholt. Es wurden gesunde Freiwillige ausgewählt, um Teilnehmer auszuschließen, die an klinisch nachweisbaren Magen-Darm-Erkrankungen oder Krankheiten leiden, die möglicherweise die Datenerfassung und -interpretation beeinträchtigen würden.

Die Teilnehmer erfüllten alle folgenden Kriterien für die Aufnahme in die Studie: (1) Personen im Alter zwischen 18 und 70 Jahren; (2) Risikoklasse 1 oder 2 für den physischen Status der American Society of Anaesthesiologists; (3) für Frauen im gebärfähigen Alter ein negativer Urin-Schwangerschaftstest innerhalb von 7 Tagen nach dem Screening-Besuch und die Bereitschaft, während des gesamten Studienzeitraums Verhütungsmittel anzuwenden; und (4) fließende Englischkenntnisse, Verständnis des Studienprotokolls und Fähigkeit, eine informierte schriftliche Einwilligung zu erteilen sowie die Studienanforderungen einzuhalten.

Teilnehmer mit einer der folgenden Erkrankungen oder Merkmale wurden von der Studie ausgeschlossen: (1) Vorgeschichte einer der folgenden Erkrankungen: frühere Magen- oder Speiseröhrenoperationen, einschließlich Schoßbandage oder bariatrische Chirurgie, Darmverschluss, Magenausgangsobstruktion, Divertikulitis, entzündliche Darmerkrankung , Ileostomie oder Kolostomie, Magen- oder Speiseröhrenkrebs, Achalasie, Divertikel der Speiseröhre, aktive Dysphagie oder Odynophagie oder aktive Medikamenteneinnahme bei Magen-Darm-Erkrankungen; (2) Schwangerschaft oder geplante Schwangerschaft innerhalb von 30 Tagen nach dem Screening-Besuch oder dem Stillen; (3) jede Form von Wirkstoffmissbrauch oder -abhängigkeit (einschließlich Drogen- oder Alkoholmissbrauch), jede instabile medizinische oder psychiatrische Störung oder jede chronische Erkrankung, die nach Ansicht des Prüfarztes die Durchführung der Studie beeinträchtigen könnte; oder (4) ein klinischer Zustand, der nach Einschätzung des Prüfarztes möglicherweise ein Gesundheitsrisiko für die an der Studie beteiligte Person darstellen könnte.

An dieser Studie nahmen 15 gesunde Personen teil, von denen jeder innerhalb von drei Tagen mindestens 17 Geräte verschluckte. Die Probengröße wurde gewählt, um die allgemeine Variation im menschlichen Darmtrakt zu beurteilen. Zu den täglichen Anweisungen gehörten die folgenden Richtlinien: Notieren Sie alle Lebensmittel und die Zeit, zu der sie im Laufe des Tages verzehrt wurden. Wenn Sie trainieren, tun Sie dies morgens. wie gewohnt frühstücken und zu Mittag essen; 3 Stunden nach dem Mittagessen ein Set aus vier Geräten mit bis zu zwei Dritteln einer Tasse Wasser schlucken; nach dem Verschlucken von Geräten mindestens 2 Stunden lang nichts essen oder trinken; Wenn Sie nach 2 Stunden hungrig sind, nehmen Sie einen kleinen Snack zu sich (bis zu 200 Kalorien); Trinken Sie nach dem Mittagessen bis zum nächsten Morgen keine koffeinhaltigen Getränke; Sammeln Sie den gesamten Stuhl ab 6 Stunden nach dem Verschlucken dieses Gerätesatzes bis 48 Stunden nach dem Verschlucken des nächsten Gerätesatzes. Essen Sie wie gewohnt mindestens 6 Stunden nach dem Mittagessen zu Abend; 3 Stunden nach dem Abendessen ein Set aus vier CapScan-Geräten mit zwei Dritteln einer Tasse Wasser schlucken; und nachdem Sie dieses Set geschluckt haben, essen oder trinken Sie bis zum Morgen nichts mehr. Alkoholkonsum und Diätinhalte wurden nicht eingeschränkt. Alle verschluckten Geräte wurden wiederhergestellt und während der Studie wurden keine unerwünschten Ereignisse gemeldet. Insgesamt stellten 274 Kapselgeräte ausreichend Material für die Metabolomik-Analyse bereit und 225 lieferten ausreichend Volumen oder Anzahl an Sequenzierungsablesungen (>2.500) für die Genomanalyse. Jeder Stuhlgang während der Studie wurde vom Teilnehmer sofort bei −20 °C eingefroren. Teilnehmer 1 stellte zusätzliche Proben zur Beurteilung der Reproduzierbarkeit zur Verfügung. Insgesamt wurden 333 Darm- und Stuhlproben mit Metabolomics-Methoden analysiert.

Die Probenvorbereitung erfolgte mithilfe einer zweiphasigen Extraktion64 mit Wasser, Methanol und Methyl-tert-butylether (MTBE), um polare und unpolare Metaboliten zu trennen. Der Überstand der Kapselvorrichtung und die Stuhlproben wurden getrennt vorbereitet, da die Geräteproben flüssig und die Stuhlproben fest waren. Von jeder überstehenden Probe wurden 10 µl in einer vorher festgelegten, zufälligen Reihenfolge in eine Vertiefung einer 96-Well-Platte zur tiefen Probenvorbereitung aliquotiert. Die Proben wurden jeweils auf einer 96-Well-Platte extrahiert und alle Schritte wurden bei 4 °C durchgeführt, sofern nicht anders angegeben. Zwischen jeweils zehn Versuchsproben wurden eine Blindprobe und eine externe QC-Probe vorbereitet. Die Leerproben verwendeten 10 µl Wasser in LC-MS-Qualität anstelle der Probe und die QC-Proben verwendeten 10 µl gepoolte Proben des Inhalts des menschlichen Magen-Darm-Trakts aus nicht verwandten Studien. Dann wurden 170 µl Methanol mit SPLASH LIPIDOMIX Mass Spec Standard (Avanti) in jede Vertiefung gegeben und die Platte mit Folie heißversiegelt, 30 s lang bei Raumtemperatur kräftig geschüttelt, entsiegelt und 490 µl MTBE hinzugefügt. Anschließend wurde die Platte erneut heißversiegelt, 30 s lang bei Raumtemperatur kräftig gevortext und 5 min lang auf einem Orbitalschüttler geschüttelt. Die Folienversiegelung wurde entfernt und 150 µl Wasser in LC-MS-Qualität in jede Vertiefung gegeben. Die Platte wurde 30 Sekunden lang bei Raumtemperatur gevortext und 12 Minuten lang bei 708 g zentrifugiert. Die Folie wurde von der Deep-Well-Platte entfernt und zwei 180-µl-Aliquots der oberen Phase wurden mit einer 12-Kanal-Pipette auf zwei 96-Well-Vanquish-LC-Platten übertragen. Zwei 50-µl-Aliquots der wässrigen Phase wurden dann auf zwei andere Vanquish LC-Platten mit 96 Vertiefungen übertragen. Alle 96-Well-Platten wurden vollständig unter Vakuum bei Raumtemperatur getrocknet, mit Folie heißversiegelt und bis zur weiteren Analyse bei –80 °C gelagert. Jede Stuhlprobe wurde durch Mischen mit einem Spatel vorbereitet und 5 ± 1 mg wurden in ein 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen überführt. Anschließend wurden allen Mikrozentrifugenröhrchen 225 µl Methanol mit SPLASH LIPIDOMIX Mass Spec Standard (Avanti) zugesetzt und die Röhrchen 10 s lang bei Raumtemperatur gevortext. In jedes Röhrchen wurden zwei 3-mm-Edelstahlkugeln und 750 µl MTBE gegeben und die Proben 1 Minute lang in einem Geno/Grinder (SPEX) bei 1.500 Hz homogenisiert. Anschließend wurden 188 µl Wasser in jedes Röhrchen gegeben und jedes Röhrchen 30 s lang bei Raumtemperatur gevortext. Die Röhrchen wurden 2 Minuten lang bei Raumtemperatur mit 14.000 g zentrifugiert. Zwei Aliquots von 180 µl der organischen Phase wurden auf zwei Platten mit 96 Vertiefungen übertragen. Zwei 50-µl-Aliquots der wässrigen Phase wurden auf zwei 96-Well-Platten übertragen. Alle Platten wurden in einem Rotationsvakuumverdampfer vollständig getrocknet, mit Folie heißversiegelt und bis zur weiteren Analyse bei –80 °C gelagert.

Proben aus den Aliquots der wässrigen Phase der Probenvorbereitung wurden bei –80 °C entnommen und 35 µl 8:2 Acetonitril:Wasser mit 29 isotopenmarkierten und synthetischen internen Standards, einschließlich CUDA65, in jede Vertiefung gegeben. Die 96-Well-Platten wurden dann mit Folie versiegelt, 30 s lang bei Raumtemperatur kräftig gevortext, 5 min lang in einem Wasserbad bei Raumtemperatur beschallt und 15 min lang bei 708 g zentrifugiert. Die Platten wurden bis zur Analyse in einem Autosampler bei 4 °C gelagert (die maximale Lagerzeit im Autosampler betrug 48 Stunden). LC-MS/MS wurde mit einem Vanquish LC (Thermo Scientific) durchgeführt, der an ein QExactive HF+ Orbital-Ionenfallen-Massenspektrometer (Thermo Scientific) gekoppelt war. Die chromatographische Trennung wurde mit einer Waters Acquity UPLC BEH Amid-Säule (150 mm Länge × 2,1 mm Innendurchmesser (Innendurchmesser); 1,7 µm Partikelgröße) mit einer 5 mm Vorsäule (5 mm Länge × 2,1 mm Innendurchmesser; 1,7 mm) durchgeführt. µm Partikelgröße). Die mobile Phase A bestand zu 100 % aus Wasser und B aus Acetonitril:Wasser im Verhältnis 95:5. Beide mobilen Phasen wurden mit 10 mM Ammoniumformiat und 0,125 % Ameisensäure modifiziert. Die Flussrate betrug 400 µl min−1, die Säulentemperatur betrug 45 °C und das Injektionsvolumen betrug 3 µl. Der LC-Gradient war 100 % mobile Phase B von 0 bis 2 Minuten, 70 % B nach 7,7 Minuten, 40 % B nach 9,5 Minuten, 30 % nach 10,25 Minuten und kehrte nach 12,75 Minuten zu 100 % B zurück, um bis 17 Minuten wieder ins Gleichgewicht zu kommen . Alle Gradientenverschiebungen der mobilen Phase waren linear. Als Nadelwaschlösungsmittel wurde vor und nach der Probeninjektion Acetonitril:Wasser 1:1 verwendet. Die Bedingungen der beheizten Elektrospray-Ionisationsquelle (HESI) waren wie folgt: Hüllgasfluss 50, Hilfsgasfluss 13, Spülgasfluss 3, Kapillartemperatur 263 °C, S-Linsen-HF-Pegel 50, Hilfsgasheizungstemperatur 425 °C und Nadelspannung 3.500 V bzw. –3.500 V für den positiven bzw. negativen Ionisationsmodus. Für die vier wichtigsten Ionen wurden Spektren mit datenabhängiger MS/MS-Erfassung (DDA) gesammelt. MS-Scans wurden mit einer 60-k-Auflösung von 60–900 m/z, einem AGC-Ziel von 106 Ionen und einer maximalen Akkumulationszeit von 100 ms aufgenommen. MS/MS-Spektren wurden mit einem Auflösungsvermögen von 15 k, einem Isolationsfenster von 1 Da, einer maximalen Akkumulierungszeit von 50 ms, einem dynamischen Ausschlussfenster von 3 s, abgestuften (N)CE von 20, 30 und 60 für die Fragmentierung und 8 × gesammelt 103 AGC-Ziel. Alle Spektren wurden im Schwerpunktmodus gespeichert. Für jede gepoolte QC-Probe wurden drei Runden iterativer Ausschluss-MS/MS durchgeführt. Unmittelbar nach der Analyse wurden die Platten unter Vakuum getrocknet, mit Folie versiegelt und bei –80 °C gelagert.

Probenplatten aus den Aliquots der organischen Phase wurden bei –80 °C entnommen und 50 µl 9:1 Acetonitril/Toluol in jede Vertiefung gegeben. Die Platten wurden dann mit Folie versiegelt, 30 s lang bei Raumtemperatur kräftig gevortext, 5 min lang in einem Wasserbad bei Raumtemperatur beschallt, 15 min lang bei 708 g zentrifugiert und bis zur Analyse in einen Autosampler überführt, der bei 4 °C gehalten wurde (maximale Lagerung). Die Zeit im Autosampler vor der Analyse betrug 48 Stunden. Bei der Lipidomics LC-MS/MS-Analyse wurde ein Thermo Scientific Vanquish LC-System verwendet, das mit einem Thermo Scientific QExactive HF+ Orbital-Ionenfallen-Massenspektrometer gekoppelt war. Für die chromatographische Trennung wurde eine Waters Acquity UPLC CSH C18-Säule (100 mm Länge × 2,1 mm Innendurchmesser; 1,7 µm Partikelgröße) mit einer Vorsäule (5 mm Länge × 2,1 mm Innendurchmesser; 1,7 µm Partikelgröße) verwendet. Die mobile Phase A war 9:1 Acetonitril:Wasser und B war 8:2 IPA:Acetonitril. Für die Positivmodus-Elektronensprayionisation (ESI) wurden die mobilen Phasen mit 10 mM Ammoniumformiat und 0,1 % Ameisensäure modifiziert. Für die ESI im negativen Modus wurden die mobilen Phasen mit 10 mM Ammoniumacetat modifiziert. Die Flussrate betrug 600 µl/min, die Säulentemperatur betrug 65 °C und das Injektionsvolumen betrug 5 µl. Der Gradient der mobilen Phase betrug 15 % B von 0 bis 0,6 Min., 30 % B nach 2 Min., 48 % B nach 2,5 Min., 82 % B nach 11 Min., 99 % B nach 11,5 bis 12 Min. und 15 % B nach 12,1 Min 14,2 Min. Die HESI-Quellenbedingungen waren wie folgt: Hüllgasfluss 55, Hilfsgasfluss 15, Spülgasfluss 3, Kapillartemperatur 275 °C, S-Linsen-HF-Pegel 50, Hilfsgasheizungstemperatur 450 °C und Nadelspannung 3.500 V und –3.500 V V für positiven bzw. negativen Ionisationsmodus. Für die oberen vier Ionen wurden DDA-MS/MS-Spektren aufgenommen. MS-Scans wurden mit einer 60-k-Auflösung von 120–1.700 m/z, einem AGC-Ziel von 106 Ionen und einer maximalen Akkumulationszeit von 100 ms aufgenommen. MS/MS-Spektren wurden mit einem Auflösungsvermögen von 15 k, einem Isolationsfenster von 1 Da, einer normalisierten Kollisionsenergie von 20, 30 und 60, einem dynamischen Ausschlussfenster von 2 s, einem 8 × 103 AGC-Ziel und einer maximalen Akkumulationszeit von 50 ms gesammelt. Die Spektren wurden im Schwerpunktmodus gespeichert. Für jede gepoolte QC-Probe wurden drei Runden iterativer Ausschluss-MS/MS durchgeführt. Unmittelbar nach der Analyse aller Proben wurden die Platten unter Vakuum getrocknet, mit Folie versiegelt und bei –80 °C gelagert.

Getrocknete Proben in der wässrigen Phase, wie oben beschrieben, wurden von –80 °C entfernt und 10 µl 40 mg ml-1 Methoxyaminhydrochlorid in Pyridin in jede Vertiefung gegeben. Die Platten wurden verschlossen und 90 Minuten lang bei 30 °C geschüttelt. Die Folie wurde entfernt und 90 µl N-Methyl-N-trimethylsilyltrifluoracetamid (enthaltend interne Standards von C8-C30-Fettsäuremethylestern) in jede Vertiefung gegeben und die Platten 30 Minuten lang bei 37 °C geschüttelt. Anschließend wurde die Platte 15 Minuten lang bei Raumtemperatur mit 2.400 g zentrifugiert. Die Folie wurde entfernt und 90 µl Überstand wurden in Glasfläschchen mit Bördelverschluss und Glaseinsatz überführt und verschlossen. Die Proben wurden innerhalb von 48 Stunden nach der Derivatisierung analysiert. Die GC-MS-Analyse wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt66. Kurz gesagt, 0,5 µl wurden im Splitless-Modus durch einen Agilent 6890 GC analysiert, der mit einer RTx-5Sil MS-Säule (30 m × 0,25 mm ID, 0,25 µm 95:5 Dimethyldiphenylpolysiloxanfilm) ausgestattet war. Bei der Chromatographie wurde Helium mit 1 ml min−1 und einem Temperaturgradienten von 50 °C bis 275 °C verwendet. Die MS-Analyse wurde mit einem Leco Pegasus III TOF-Massenspektrometer durchgeführt. Spektren wurden mit 17 Spektren pro Sekunde und 70 eV EI gesammelt. Die Datendateien wurden in der Leco ChromaTOF-Software vorverarbeitet und mithilfe der automatisierten GC-MS-Datenverarbeitungspipeline BinBase67 mit FiehnLib zur Spektren- und Retentionszeitanpassung weiter analysiert.

Gallensäuren wurden wie zuvor berichtet4 gezielt und quantifiziert. Kurz gesagt, getrocknete Probenplatten in der wässrigen Phase aus der ESI+-Analyse der hydrophilen Interaktionschromatographie (HILIC) wurden aus einem Gefrierschrank mit –80 °C entnommen und in 60 µl Gallensäure-Lauflösungsmittel (1:1 ACN-Methanol, enthaltend 100 ng ml−1 von fünf Isotopen) gelöst markierte interne Gallensäurestandards). Die Platten wurden 30 Sekunden lang gevortext und 5 Minuten lang in einem Wasserbad beschallt. Alle Proben wurden 30-fach in Gallensäure-Lösungsmittel verdünnt. Alle Platten wurden 15 Minuten lang bei 4 °C und 708 g zentrifugiert und bis zur Analyse in einem Vanquish-Autosampler bei 4 °C gelagert. Eine Neun-Punkte-Standardkurve wurde zwischen 0 und 1.500 ng ml−1 erstellt und mit Proben analysiert. Für die gezielte LC-MS/MS-Analyse wurden ein Vanquish UPLC und ein Altis QqQ-Massenspektrometer (Thermo Fisher Scientific) verwendet. Eine Acquity BEH C18-Säule (100 mm × 2,1 mm Innendurchmesser, 1,7 µm Partikelgröße; Waters) wurde mit der mobilen Phase A aus Wasser und B aus Acetonitril, beide mit 0,1 % Ameisensäure, verwendet. Zur Verarbeitung und Quantifizierung von Gallensäureanalyten wurden Skyline-Software und benutzerdefinierte R-Skripte verwendet.

Die SCFA-Quantifizierung wurde durch Derivatisierung mit N-tert-Butyldimethylsilyl-N-methyltrifluoracetamid (MTBSTFA) basierend auf einem zuvor veröffentlichten Protokoll68 durchgeführt. Kurz gesagt, 10 µl Darmüberstand wurden in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis überführt, das mit 50 µl Wasser in LC-MS-Qualität, das deuteriummarkierte interne SCFA-Standards enthielt, und 10 µl 37 %iger Salzsäure vorgefüllt war. Anschließend wurden jedem Röhrchen 100 µl MTBE zugesetzt, das auch mit Deuterium markierte interne SCFA-Standards enthielt, und die Röhrchen wurden 30 Minuten lang bei Raumtemperatur auf einer rotierenden Schüttelplatte geschüttelt. Die Röhrchen wurden 2 Minuten lang bei 14.000 g zentrifugiert und 20 µl MTBE (obere Schicht) wurden in ein GC-MS-Fläschchen mit Bördelverschluss, das mit einem Einsatz mit geringer Rückgewinnung ausgestattet war, überführt. Dann wurden 5 µl MTBSTFA in jedes Fläschchen gegeben, das dann verschlossen wurde. Die Fläschchen wurden auf einer Orbitalschüttelplatte 30 Minuten lang bei 80 °C geschüttelt, auf Raumtemperatur abgekühlt und mittels GC-MS analysiert. Ein Agilent 6890 GC gekoppelt mit einem Leco Pegasus IV TOF-Massenspektrometer wurde mit einer DB5 DuraGuard-Kapillarsäule (30 m × 0,25 mm × 0,25 µm) verwendet. Anschließend wurde 1 µl bei aktiviertem 1:10-Split-Modus, einer Heliumflussrate von 1,2 ml/min, einem Temperaturanstieg von 50 °C auf 290 °C über 20,8 Minuten und einer Scanrate von 17 Spektren pro Minute von 50–550 injiziert m/z. Für jeweils 80 Proben wurde eine Sechs-Punkte-Standardkurve zwischen 1 und 100 µg ml-1 analysiert, und für jeweils zehn Versuchsproben wurden Leerproben analysiert. Proben und Standardkurvenmischungen wurden innerhalb von 24 Stunden nach der GC-MS-Analyse hergestellt. Die Daten wurden in das Agilent-Format (.d) konvertiert und mit Agilent MassHunter Quant vB09.00 verarbeitet. Zur Quantifizierung von SCFAs in experimentellen Proben wurden lineare Sechspunkt-Standardkurven unter Verwendung des Verhältnisses von Analyt zu internem Standard verwendet.

MS-DIAL v.4.80 (Ref. 58) wurde zur Verarbeitung ungezielter LC-MS/MS-Daten verwendet. HILIC LC-MS/MS- (ESI+ und ESI−) und Lipidomics-Datensätze (ESI+ und ESI−) wurden mit manuell optimierten Parametern verarbeitet (Ergänzungstabelle 9). Die Peakhöhe wurde für alle ungezielten Analysen angegeben. Experimentelle MS/MS-Spektren wurden mit MassBank of North America sowie NIST20-Spektralbibliotheken für HILIC-Analysen abgeglichen und alle Lipid-Referenz-MS/MS-Spektren von MS-DIAL wurden für Lipidomic-Analysen verwendet. Informationen zur Retentionszeit für HILIC und Lipidomics aus authentischen Standards, die unter identischen Chromatographiebedingungen durchgeführt wurden, wurden als weitere Beweislinie für die Annotation von Metaboliten verwendet. Metabolitenanmerkungen basierten auf einem genauen Massenabgleich mit der Retentionszeit und/oder einem MS/MS-Abgleich mit einem Bibliotheksspektrum. Die Blindwertsubtraktion wurde durchgeführt, indem LC-MS-Merkmale beibehalten wurden, bei denen die maximale Intensität einer experimentellen Probe mindestens zehnmal so hoch war wie der Durchschnitt der Methodenblindwerte, zusammen mit einer weiteren Datenreduzierung, wie in der Ergänzungstabelle 2 beschrieben. Der letzte Schritt von Bei der Datenverarbeitung handelte es sich um eine manuelle Untersuchung annotierter Merkmale auf MS/MS-Übereinstimmungsqualität, Peakqualität, Peakausrichtung und Entfernung von In-Source-Fragmenten unter Verwendung der Korrelation zwischen Features mit enger Retentionszeit zur Identifizierung von In-Source-Fragmenten. Wenn mehrere Metaboliten aus Spektralbibliotheken mit einem experimentellen MS/MS übereinstimmten, wurde die Übereinstimmung als nicht eindeutige MS/MS-Übereinstimmung aufgezeichnet (Ergänzungstabelle 1). Die mit Retip69 berechneten prognostizierten Aufbewahrungszeiten wurden als zusätzliche Beweislinie verwendet, um Anmerkungen von geringer Qualität zu kennzeichnen.

Die DNA wurde mit einem Mikroben-DNA-Extraktionskit (QIAGEN) in 70 und 50 µl aus einem Kapselgerät oder 100 mg Stuhl extrahiert. Die 16S-rRNA-Amplikons wurden unter Verwendung der vom Earth Microbiome Project empfohlenen 515F/806R-Primerpaare und 5PRIME HotMasterMix (Quantabio, 2200410) mit dem folgenden Programm in einem Thermocycler erzeugt: 94 °C für 3 Minuten, 35 Zyklen von 94 °C für 45 Sekunden, 50 °C für 60 s und 72 °C für 90 s, gefolgt von 72 °C für 10 min. PCR-Produkte wurden mit dem UltraClean 96 PCR Cleanup Kit (QIAGEN, 12596-4) und dem Quant-iT dsDNA High Sensitivity Assay Kit (Invitrogen, Q33120) gereinigt, quantifiziert und gepoolt. Die Proben wurden mit 300-bp-Reads auf einem MiSeq (Illumina) sequenziert. Sequenzdaten wurden mithilfe des Illumina bcl2fastq-Algorithmus in der Chan Zuckerberg BioHub Sequencing-Einrichtung demultiplext. Die anschließende Verarbeitung wurde mit der R-Statistik-Rechenumgebung v.4.0.3 (Ref. 71) und DADA2 wie zuvor beschrieben unter Verwendung von Pseudo-Pooling72 durchgeführt. Die Parameter truncLenF und truncLenR wurden auf 250 bzw. 180 gesetzt. Die Taxonomie wurde mithilfe der Silva-rRNA-Datenbank v.132 (Lit. 73) zugewiesen. Proben mit >2.500 Messwerten wurden für Analysen aufbewahrt.

Statistische Tests wurden mit R71 durchgeführt. LMMs wurden mit den Paketen lmerTest und lme4 R durchgeführt. Um räumliche Unterschiede im gesamten Darm zu untersuchen, verwendeten wir LMMs, die den Probenahmeort (proximal (Gerätetypen 1 und 2) oder distal (Gerätetypen 3 und 4)) und acht aus Lebensmittelprotokollen klassifizierte Lebensmitteltypen (pflanzliches und tierisches Protein (Fleisch)) berücksichtigten , Ei und Fisch), Getreide (Reis, Nudeln, Brot und anderes Getreide), Kaffee oder Tee, Dessert oder Alkohol (Bier, Wein oder alkoholischer Selters), Milchprodukte und Obst) und Antibiotikakonsum innerhalb von 6 Monaten als Variablen mit fester Wirkung und inter -individuelle Variation als Zufallseffektvariable (Ergänzungstabellen 3 und 4). Die Lebensmittelarten wurden manuell anhand der schriftlichen Lebensmittelprotokolle der Teilnehmer mithilfe individueller Bewertungsformulare zugewiesen. Die Metabolitenhäufigkeit wurde log10-transformiert und fehlende Werte wurden als Nullen behandelt, gefolgt von einer Skalierung von –1 und 1 vor der LMM-Analyse. Eine Benjamini-Hochberg74-Korrektur wurde verwendet, um das Testen mehrerer Hypothesen zu berücksichtigen. Korrelationen zwischen der Mikrobiota (log2-skalierte Amplikonsequenzvariantenhäufigkeit) und Metaboliten (log10-skalierte Metabolitenhäufigkeit) wurden auf der Ebene der Amplikonsequenzvarianten unter Verwendung von Pearson-Korrelationen berechnet. Für FAHFAs und Sulfonlipide wurde in einer Anwesenheits-/Abwesenheitsanalyse eine differenzielle Häufigkeitsanalyse unter Verwendung der differenziellen Limma-Voom-Häufigkeit durchgeführt. Es wurden nur Taxa mit einer absoluten Differenzhäufigkeit > 0,75 und einem Benjamini-Hochberg-korrigierten P < 0,1 berücksichtigt. Zur Berechnung der Anreicherungsstatistik wurde ChemRICH75 verwendet. Die Clusterbildung wurde unter Verwendung der hclust-Funktion mit der Spearman-Rangkorrelationsmatrix des Metaboliten durchgeführt, die unter Verwendung der cor-Funktion in R berechnet wurde, und des euklidischen Abstands, der mit der as.dist-Funktion in R berechnet wurde. PLS-DA und Hauptkomponentenanalyse (PCA) wurden mit den Ropls durchgeführt Paket in R76. PLS-DA-Modelle zur Unterscheidung von Teilnehmer- und Gerätetyp wurden durch siebenfache Kreuzvalidierung bewertet. Unter Verwendung von 20–1.000 zufälligen Permutationen von Klassenbezeichnungen, die vom Paket ropls R durchgeführt wurden, um auf Überanpassung zu testen, behielten die Modelle Q2Y > 0,15 und P < 0,05 bei (Lit. 77). Ungezielte LC-MS/MS-Funktionen (HILIC und RP ESI+/-) wurden auf die Summe der internen Standards für jede Plattform normalisiert, was sich als robuster erwiesen hat als Normalisierungen auf einzelne Verbindungen78. Diese Normalisierung wurde durchgeführt, indem jedes LC-MS-Merkmal durch die Summe der Peakhöhen des internen Standards für diese Probe dividiert wurde78,79. GC-MS-Daten wurden auf die summierte Intensität aller annotierten Metaboliten normalisiert, wie in veröffentlichten Protokollen ausführlich erörtert80. Diese Methode befasst sich mit den für GC-Methoden spezifischen Unterschieden und wird kürzlich als Normalisierung auf die gesamte nutzbare Peakfläche81 bezeichnet. Gepoolte QC-Daten wurden im Vergleich zu CapScan- und Stuhlproben in einem dichten Cluster gefunden (erweiterte Daten, Abb. 1). Beim Zusammenführen von Datensätzen wurden durch mehrere Assays erkannte Metaboliten vereinfacht, um nur Daten von einem Gerät zu behalten, wobei Daten aus dem Assay mit geringerer technischer Varianz (%-Varianzkoeffizient der gepoolten QC) bevorzugt beibehalten wurden. Metaboliten, die nur in einem einzigen Assay nachgewiesen wurden, blieben im Datensatz, unabhängig vom prozentualen Varianzkoeffizienten der gepoolten QC (Ergänzungstabelle 1). Für jeden Metaboliten wurden vor PCA und PLS-DA eine Log10-Transformation und eine Nullwertimputation unter Verwendung eines Zehntels der minimal gemeldeten Peakhöhe für nicht erkannte Merkmale durchgeführt.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Rohdaten der Massenspektrometrie sind auf der Metabolomics Workbench (https://www.metabolomicsworkbench.org/) unter den Studien ST002073, ST002075, ST002407, ST002409 und ST002411 verfügbar. Die 16S- und Metagenomik-Sequenzierungsdaten sind auf NCBI unter BioProject PRJNA822660 verfügbar. Die Taxonomie wurde mithilfe der Silva rRNA-Datenbank v.132 (https://www.arb-silva.de/) zugewiesen. Massenspektren wurden mithilfe der öffentlichen Bibliotheken der MassBank of North America (https://massbank.us/) und der vom NIST lizenzierten NIST20-Bibliotheken annotiert. Skripte werden bei Zenodo archiviert (https://zenodo.org/record/7659119#.ZBGhMh_P23A).

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Nam, SL, de la Mata, AP, Dias, RP & Harynuk, JJ Auf dem Weg zur Standardisierung von Datennormalisierungsstrategien zur Verbesserung von Urin-Metabolomics-Studien durch GC× GC-TOFMS. Metaboliten 10, 376 (2020).

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J. Wells und Z. Tippins halfen bei massenspektrometrischen Analysen am West Coast Metabolomics Center. R-Code von D. Barupal wurde für ChemRICH-Bewertungen verwendet, wie er von seiner GitHub-Site heruntergeladen wurde. C. Brydges war als Berater zu statistischen Regressionsanalysen tätig. Diese Studie wurde durch das USDA 2021-67017-35783 an OF, den Zuschuss RM1 GM135102 der National Institutes of Health (NIH) an KCH und den Zuschuss EF-2125383 der National Science Foundation an KCH finanziert. Das Gehalt für JF wurde durch die Zuschüsse NIH R01 AT010216 und NIH U19 bereitgestellt AG023122. Dieses Material basiert auch auf Arbeiten, die von der National Science Foundation unter der Fördernr. 1936687 bis DSJG wurde durch ein Dean's Fellowship der Stanford University School of Medicine und durch NIH F32 DK130574 unterstützt. DAR wird vom Thomas C. and Joan M. Merigan Endowment der Stanford University unterstützt. KCH und DAR sind Chan Zuckerberg Biohub Investigators.

West Coast Metabolomics Center, University of California, Davis, CA, USA

Jacob Folz, Juan Montes Morales & Oliver Fiehn

Abteilung für Genetik, Stanford University School of Medicine, Stanford, CA, USA

Rebecca Neal Culver

Medizinische Fakultät, Stanford University School of Medicine, Stanford, CA, USA

Jessica Grembi und David A. Relman

Silicon Valley Neurogastroenterology and Motility Center, Mountain View, CA, USA

George Triadafilopoulos

Abteilung für Mikrobiologie und Immunologie, Stanford University School of Medicine, Stanford, CA, USA

David A. Relman und Kerwyn Casey Huang

Chan Zuckerberg Biohub, San Francisco, CA, USA

David A. Relman und Kerwyn Casey Huang

Abteilung für Infektionskrankheiten, Veterans Affairs Palo Alto Health Care System, Palo Alto, CA, USA

David A. Relman

Abteilung für Bioingenieurwesen, Stanford University, Stanford, CA, USA

Kerwyn Casey Huang

Live Bio, San Francisco, CA, USA

Von Sharon

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OF, KCH und DS haben die Studie entworfen. JF erfasste und verarbeitete Metabolomdaten, führte mit Unterstützung von JMMJF statistische Analysen durch und erstellte Abbildungen und Tabellen. GT rekrutierte Teilnehmer und holte Einwilligungen und Proben ein. KCH, RNC, JG und DAR erfassten, verarbeiteten und analysierten Mikrobiomdaten. JF und OF haben das Manuskript mit Beiträgen von DS, KCH, GT und RNC verfasst. Alle Autoren haben die endgültige Version des Manuskripts genehmigt.

Korrespondenz mit Oliver Fiehn.

DS ist Angestellter und besitzt eine Kapitalbeteiligung an Envivo Bio, einem Unternehmen mit Interesse am menschlichen Magen-Darm-Trakt. Alle anderen Autoren erklären keine Interessenkonflikte.

Die Studie wurde von einer unabhängigen Organisation, der Copernicus Group innerhalb des Western Institutional Review Board, unter Studiennr. geprüft und genehmigt. 1186513. Von jedem Teilnehmer wurde eine Einverständniserklärung eingeholt.

Nature Metabolism dankt Robert Quinn und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Hauptredakteur für Handhabung: Ashley Castellanos-Jankiewicz, in Zusammenarbeit mit dem Nature Metabolism-Team.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

a, Proben-pH-Wert für Gerätetypen zur Darmprobenahme. Die Kästchen stellen einen Interquartilbereich von ±1 dar, und die Linie erstreckt sich bis zu der Stichprobe, die am weitesten von der Medianstichprobe entfernt ist, mit einer maximalen Ausdehnung von 1,5 Interquartilbereichen vom Median. Alle Proben werden als einzelne Punkte dargestellt. (n = 274 Geräte insgesamt, Gerätetyp 1 = 75, Gerätetyp 2 = 70, Gerätetyp 3 = 69, Gerätetyp 4 = 60) ****: p < 0,0001 (Wilcoxon-Rang mit Vorzeichen). b, Hauptkomponentenanalyse (PCA) normalisierter Peakhöhen aus dem Metabolomics-Datensatz. Bei QC-Proben handelt es sich um gepoolte Darminhalte aus menschlichen Darmtraktproben.

Proben und Metaboliten werden durch hierarchische Clusterbildung auf der x- bzw. y-Achse organisiert. Jede Probe ist mit der Probandennummer und dem Probentyp (Gerätetyp oder Stuhl) gekennzeichnet. Die Farbe stellt die Metabolitenhäufigkeit dar, und die Mindest- und Höchstwerte werden für jeden Metaboliten (Zeile) individuell festgelegt.

Proben werden auf der x-Achse nach Gerätetyp organisiert, und Metaboliten werden auf der y-Achse nach hierarchischer Clusterbildung organisiert. Die Farbe stellt die Metabolitenhäufigkeit dar, und die Mindest- und Höchstwerte für die Farbskala werden für jeden Metaboliten (Zeile) individuell festgelegt.

Daten von Geräten 1 + 2 (proximal) im Vergleich zu Daten von Geräten 3+4 (distal). Die Signifikanz wurde mithilfe eines linearen Mixed-Effect-Modells (LMM) berechnet. Die horizontale gestrichelte Linie stellt die Signifikanzschwelle von p < 0,05 dar (genaue p-Werte finden Sie in der Ergänzungstabelle 4). Kreise zeigen Metaboliten mit nicht signifikanten Unterschieden nach Korrektur der falschen Entdeckungsrate (FDR) oder einem Effektgrößenkoeffizienten < ± 0,2 an. Rauten zeigen Metaboliten mit signifikanten (p<0,05) Unterschieden nach FDR-Korrektur (n = 9.317) und einem Effektgrößenkoeffizienten > ± 0,2 an. In diese Analyse wurden nur Merkmale einbezogen, die in >50 % der Darmproben nachgewiesen wurden (n = 9.317 Merkmale). Der Effektgrößenkoeffizient ist die vom LMM geschätzte Steigung, wobei ein positiver (negativer) Koeffizient einen Metaboliten darstellt, der im distalen im Vergleich zum proximalen oberen Darm höher (niedriger) ist. Vertikale gestrichelte Linien entsprechen dem ±0,20-fachen des Effektgrößenkoeffizienten.

Statistiken zur chemischen Anreicherung wurden von ChemRICH durchgeführt. Metaboliten, die in >50 % der Darmproben nachgewiesen wurden, wurden in diese Analyse einbezogen (n = 1182 Metaboliten). Diese Ergebnisse wurden durch die Trennung der Klassen nach chemischer Lipophilie (logP) und dem Signifikanzniveau der chemischen Klasse von -log10 (p-Wert) visualisiert. Rote Kreise zeigen an, dass die chemische Klasse im distalen im Vergleich zum proximalen oberen Darm höher war, und blaue Kreise zeigen an, dass die chemische Klasse im distalen im Vergleich zum proximalen oberen Darm niedriger war. Lila zeigt an, dass der chemische Cluster deutlich höhere Metaboliten sowie deutlich niedrigere Metaboliten im distalen als im proximalen oberen Darm aufweist. Die Kreisgröße gibt die Größe der chemischen Klasse an.

a, Die Anzahl der Metaboliten, die sich zwischen den Darmregionen (Gerätetypen) oder zwischen den Mahlzeiten (Probenahmezeitpunkte von vier Kapselgeräten) deutlich unterschieden, berechnet für jede Person durch Varianzanalyse (Kruskal-Wallis). Für diese Analyse wurden nur Metaboliten verwendet, die in >50 % der Proben für jeden Probanden nachgewiesen wurden (n = 1182 Metaboliten). Als Signifikanzschwelle wurde ein nicht FDR-korrigierter p < 0,05 verwendet. b: Eine multivariate Diskriminanzanalyse (PLS-DA) wurde durchgeführt, um Metaboliten zu identifizieren, die für die Unterscheidung zwischen Probanden oder Regionen am wichtigsten waren. Die 100 Metaboliten, die für die Unterscheidung dieser Gruppen am wichtigsten sind, wurden im Projektionsscore (VIP) nach variabler Bedeutung geordnet und nach chemischen Unterklassen kategorisiert. Chemische Unterklassen mit <3 Metaboliten werden als „Sonstige“ gemeldet.

Für diese Analyse wurden nur Metaboliten verwendet, die in >50 % der Proben für jeden Probanden nachgewiesen wurden (n = 1182 Metaboliten). Als Signifikanzwert-Grenzwert wurde ein nicht FDR-korrigierter p < 0,05 verwendet. a, Metaboliten mit signifikant unterschiedlicher Häufigkeit zwischen den Darmregionen für jedes Subjekt, gruppiert nach chemischer Klasse und dem Anteil jeder chemischen Klasse. b, Metaboliten mit signifikant unterschiedlicher Häufigkeit zwischen den Probenahmezeitpunkten, gruppiert nach chemischer Klasse und dem Anteil jeder chemischen Klasse.

Zu den Metaboliten gehören Gallenfarbstoffe, Fettsäureester von Hydroxyfettsäuren (FAHFAs und AAHFAs), kurzkettige Fettsäuren, Sulfonlipide (SLs) und sekundäre Gallensäuren. Es werden Daten aller Stuhlproben angezeigt und die Proben nach Themen geordnet. Hervorgehoben sind die beiden Probanden, die 1 und 5 Monate vor dieser Studie Antibiotika eingenommen haben. Der Farbbalken stellt die Metabolitenhäufigkeit (Peakhöhe) oder Konzentration (ng/ml) für Gallensäuren dar. Minimal- und Maximalwerte wurden verwendet, um die Farbskala für jeden Metaboliten (jede Zeile) festzulegen.

Metaboliten sind Fettsäureester von Hydroxyfettsäuren (FAHFAs und AAHFAs) und Fettsäuren, die in mehr als 50 % aller Geräteproben nachgewiesen wurden. Alle Gerätebeispiele werden angezeigt und nach Themen geordnet. Innerhalb der oberen (FAHFA) und unteren (Fettsäure) Abschnitte sind die Metaboliten auf der Grundlage einer hierarchischen Clusterung geordnet. Der Farbbalken stellt die Metabolitenhäufigkeit (Peakhöhe) oder Konzentration (ng/ml) für Gallensäuren dar. Minimal- und Maximalwerte wurden verwendet, um die Farbskala für jeden Metaboliten (jede Zeile) festzulegen.

Ergänzende Abbildungen. 1–3.

Ergänzungstabellen 1–9.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Folz, J., Culver, RN, Morales, JM et al. Variation des menschlichen Metaboloms entlang des oberen Darmtrakts. Nat Metab 5, 777–788 (2023). https://doi.org/10.1038/s42255-023-00777-z

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Eingegangen: 24. September 2022

Angenommen: 03. März 2023

Veröffentlicht: 10. Mai 2023

Ausgabedatum: Mai 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42255-023-00777-z

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